Regulace transkripce u prokaryot Regulace transkripce u prokaryot - kapitola 16 Restrikční enzymy - kapitola 5 Molekulární klonování – kapitola 4 a 5

Výsledek testu

Obecný mechanismus replikace DNA polymeráza potřebuje RNA primer Okazakiho fragmenty (1000 – 2000bp) Odstranění primerů exonuklázovou aktivitou DNAP Ligace niků

DNA polymeráza III Několik podjednotek DnaE (-podjednotka, syntéza) DnaQ (-podjednotka, proof-reading – korekturní aktivita) HolE (-podjednotka, potřebná pro stabilitu) DnaN (-podjednotka) Přídatné podjednotky (, , , , ) – clamp loading complex

RT PCR Složitá manipulace s geny obsahující exony mRNA již obsahuje sekvenci, která je translatovatelná Pomocí reverzní transkriptázy (enzym z retrovirů) vytvoření DNA z mRNA Vytvoření jednoho vlákna cDNA – templátová DNA Studium exprese genů

Regulace exprese genů E.coli Ze 4000 genů je exprimováno v každý okamžik alespoň 1000 Dle podmínek, geny jsou zapnuty a vypnuty Změna teploty  změna exprese 50-100 genů Figure 16.1 2D Protein Gels of E. coli under Different Conditions E. coli was grown in 50 mM acetate or 20 mM formate. Three gels were run for each condition and the Figure shows a layered view of two three-gel composites. The pink and green spots are proteins induced in acetate or formate, respectively. The circled spots are those that were statistically validated, based on a pair-wise comparison of all the individual gels. (Credit: Joan L. Slonczewski and Christopher Kirkpatrick, Kenyon College, Gambier, Ohio.)

Regulace exprese Jednobuněčný organismus reguluje expresi svých genů v závislosti na změně prostředí (teplota, osmolarita, zdroj látek), či vnitřních signálů (příprava na dělění apod.) Regulace probíhá na mnoha úrovních: Na úrovni transkripce primárního transkriptu Na úrovni úpravy primárního transkriptu Na úrovni stability transkriptu Na úrovni translace Na úrovni úpravy a sbalení peptidového řetězce do funkčního proteinu Na úrovni kontroly aktivity proteinu Na úrovni degradace proteinu

Efektivní vs rychlá regulace Efektivní regulace je na úrovni transkriptu Vyžaduje méně energie Rychlá regulace je na úrovni proteinu Protein je vždy připraven plnit svou funkci

Pozitivní vs negativní regulace Gen se nepřepisuje, pokud není aktivován Negativní Exprese genu je pozastavena dokud není represor vyvázán TEST

Regulace transkripce Na úrovni přístupu transkripčních faktorů k DNA Důležitější u E (heterochromatin) U P – ne až tak důležitá Na úrovni rozeznání promotoru U E – tři různé RNAP U P – 1 RNAP, ale různé  faktory Na úrovni iniciace transkripce Nutná přítomnost aktivačních proteinů Represor blokuje postup RNAP Na úrovni elongace mRNA Ne úplně běžné (zpomalení elongacem či předčasné ukončení transkripce) Na úrovni terminace mRNA Anti-terminator proteiny Umožňuje transkripci genů downstream od terminátoru

Extracytoplasmic heatshock  - faktory  podjednotka RNAP rozeznává promotor Alternativní  faktory Sigma factor Jméno Consensus sequence -35 mezera -10 Housekeeping 70 RpoD TTGACA 16-18 TATAAT Stationary phase 38 RpoS CCGGCG CTATACT Nitrogen control 54 RpoN TTGGNA 6 TTGCA Flagellar motion 28 FliA CTAAA 15 GCCGATAA Heat shock 32 RpoH CTTGAA 13-15 CCCCATNT Extracytoplasmic heatshock 24 RpoE GAACTT 16 TCTGAT

 Faktor tepelného šoku Při vysoké teplotě  proteiny se špatně balí, ztrácí svou funkcí  agregují E.coli 37°C – OK 43° - pořád OK 46°C -  exprese heat shock proteinů (30% z celkového množství proteinů) Chaperony (pomáhají správně sbalit protein) Proteázy (degradují špatně sbalené proteiny) RpoH a RpoE

RpoH RpoH 30°C – není potřebný, je rychle degradován 42°C - protein je stabilní,  se jeho exprese 50°C – aktivace exprese dalších heat shock genů, RpoH je posléze inaktivován Transcripce RpoH genu je pod normálním promotorem (70 – ten je neaktivní při teplotě nad 50°C) a také pod promoterm vázající 24 (RpoE, transkripce pokračuje do 57°C, kdy RNAP je destabilizována)

Formace spory u Bacillus Kaskáda alternativních  faktorů Když je nouze o výživné látky  sporulace  faktory důležité pro vytvoření spóry E a K – v mateřské buňce Pre- E – environmentální signály zapínají expresi F a G – ve sporulující buňce F – transkripce ranných sporulujících genů (aktivují pre- E) G – transkripce pozdních sporulujících genů (aktivují pre –K)

Formace spory u Bacillus Kaskáda alternativních  faktorů Když je nouze o výživné látky  sporulace  faktory důležité pro vytvoření spóry E a K – v mateřské buňce Pre- E – environmentální signály zapínají expresi F a G – ve sporulující buňce F – transkripce ranných sporulujících genů (aktivují pre- E) G – transkripce pozdních sporulujících genů (aktivují pre –K)

Anti- a anti-anti-sigma faktory Anti sigma faktory se vážou na  faktory a zabraňují nasednutí na promotor SpoIIAB je anti-sigma faktorem pro F SpoIIAA je anti-anti sigma faktorem a uvolňuje F

Aktivátor vs represor Aktivátor – transkripční faktor, nutný pro expresi genu Represor – vypíná expresi genu U pozitivní regulace – aktivátor nutný pro zapnutí exprese U negativní regulace – represor neumožňuje transkripci dokud není vyvázán Indukční činidlo (inducer) Obvykle malá signální sloučenina (živina) váže se na regulační proteinu

Operon Kluster genů pod jedním promotorem Polycistronická mRNA Francois Jacob and Jaques Monod – poprvé definovali operon – negativně regulovaný laktózový operon Nobelova cena v roce 1965 (s Andre Lwoff)

Lac operon Lac operon: LacI – represor LacO - operátor lacZ – β galaktosidáza lacY – permeáza laktózy lacA – acetyláza laktózy (není esenciální) LacI – represor Upstream of lacAYZ V opačném směru LacO - operátor TEST

Lac operon Lac operon: LacI – represor LacO – operátor lacZ – β galaktosidáza lacY – permeáza laktózy lacA – acetyláza laktózy (není esenciální) LacI – represor Upstream of lacAYZ V opačném směru LacO – operátor Inducer – allo-laktóza, IPTG Lac operon je vždy trošičku aktivní Lac operon neni úplně standardní

Negativní represibilní regulace trp operonu Operon pro syntézu tryptofanu – trpEDBCA Represor – trpR Opačný systém než Lac operon!

Negativní represibilní regulace trp operonu - atenuace U prokaryot k translaci může docházet ihned po zahájení transkripce TrpL – leader 130bp Sekvence 1,2,3,4 – mohou vytvořit vlásenku Obsahuje velmi vzácné kodóny pro Trp Atenuace Není to on/off Translace je vyladěna na přítomnost trp

araBAD operon Jeden protein může být aktivátorem a represorem zároveň Aktivátor se obvykle váže před promotor (upstream) Pomáhá rozeznat oblast a vazbě na DNA Represor se obvykle váže na oblast za promotorem (downstream) Brání vazbě RNAP na promotor Brání posunu RNAP vpřed

araBAD operon Jeden protein může být aktivátorem a represorem zároveň (vážou se na různou oblast DNA) AraC – regulační protein kontrolující transport a metabolism arabinózy AraBAD (metabolismum) a AraFG (transport, uptake) operony jsou reprimovány AraC při absenci arabinózy, a aktivovány při její přítomnosti

Ko-represory Některé represory jsou aktivní pouze, pokud vážou nějakou molekulu Velmi časté u biosyntetických metabolických drah Příklad: arginin

Represory vázající se na protein Mlc Represe genů účastnící se metabolismu glukózy Při absenci glukózy, transporter PtsG je fosforylován Přítomnost glukózy vede k jeho defosforylace PtsG váže Mls Exprese genů je spuštěna

Kovalentní modifikace represorů a aktivátorů OxyR Oxidace OxyR peroxidem vodíku Oxiduje –SH skupiny na S-S skupiny – aktivace a vazba na DNA Spuštění exprese genů na protekci proti oxidativnímu stresu Fnr Redukce Fnr spouští jeho aktivní funkci - dimerizuje (např. při anaerobních podmínkách) Aktivace genů důležitých pro anaerobní respiraci

Dvousložkový regulační systém Přidání chemické skupiny pomocí kovalentní vazby (fosfát, methyl, acetyl, AMP, ADP-riboza atd.) 2 složky DNA vázající protein, váže DNA pouze když je fosforylovaný (REGULATOR) Kináza vnímavá na změny prostředí (SENSOR) Příklady: Nedostatek kyslíku (ArcB a ArcA) – reprimuje 20 genů, které jsou nutné pouze při aerobním metabolismu, aktivuje 6 genů nutné pro růst za anearobních podmínek Deprivace fosfátu (PhoR a PhoB) Metabolismus dusíku (NtrB a NtrC) Sensor Regulator

Globální regulace Regulon – skupina genů a operonů, které jsou regulovány jedním regulačním proteinem při spuštění jednoho signálu syntéza argininu ( 12 různých genů/operonů) regulovány jedním represorem Metabolismus cukrů – globální aktivátor Crp

Globální regulace - Crp Crp - cyclic AMP receptor protein Crp zapíná geny pro metabolismus maltózy, laktózy a dalších při absenci glukózy cAMP je signál, že buňka má málo glukózy Lac operon je tudíž řízen nejenom lacI, ale take Crp Cyclic AMP dimer TEST

Regulační nukleotidy Regulační nukleotidy cAMP cGTP – vyšší organismy cAMP je produkování adenylát cyklázou Přítomnost glukózy inhibuje syntézu cAMP, stimuluje export cAMP ven z buňky cGTP – vyšší organismy c-di-GTP - důležitý pro biofilm produkující baktérie Reguluje tranzici mezi volně-plavající a biofilm vytvářející bakterií Produkce polymeru N-acetyl-D-glucosaminu Biofilm umožňuje baktérií přilnout k povrchu (př. Yersinia pestis, mor, blecha) ppGpp – kontrola hladovění u baktérií

Regulační nukleotidy – druhý posel Když nejsou aminokyseliny Když je glukóza Když nejsou aminokyseliny Když není glukóza Bacteria Use Second Messengers to Control Gene Expression Three basic second messenger control systems are shown. A) Cyclic AMP (cAMP) is synthesized by adenylate cyclase (Cya) when the phosphotransferase system signals an absence of glucose, and degraded by a phosphodiesterase (CpdA) when glucose is present again. Cyclic AMP activates transcription of many different genes through its interaction with the cyclic AMP receptor protein (CRP), and initiates replication via DnaA protein to adapt to the change in sugar availability. B) (p)ppGpp is created by RelA conversion of GDP and ATP in response to amino acid deprivation, and degraded by a RelA/SpoT homolog when amino acids are abundant. (p)ppGpp and DskA bind to RNA polymerase directly which changes the transcription of many different genes to adapt to the lack of amino acids by slowing growth. C) Cyclic-di-GMP (c-di-GMP) is created from two GTP molecules by enzymes that contain a protein domain called “GGDEF” and degraded by proteins that contain the domains called “EAL” and “HD-GYP.” Multiple copies of enzymes with these specific domains exist. When expressed, cyclic-di GMP alters gene expression via a variety of targets that are still being investigated. This second messenger specifically activates genes associated with biofilm formation and cell cycle regulation. (Credit: Pesavento C and Hengge R (2009) Bacterial nucleotide-based second messengers Curr Op Microbiol 12:170–176.)

DNA vázající proteiny Histone-like proteiny Nepřímé nespecifické H-NS (histone-like nucleoid structuring) 2 domény: DNA vazebnou doménu Protein-protein interakční doménu Agregují (tetramery) Vazba na A/T bohaté oblasti – reprimují expresi

Regulace na dálku HU (heat unstable nucleoid protein) a IHF (integration host factor) Pozitivní regulátory Heterodimery Ohýbají DNA Pomáhají tak genovým inverzím, integracím, rekombinacím Regulují expresi přiblížením regulačních proteinů

Regulace na dálku Geny pro metabolismus dusíku Alternativní 54 (RpoN) Aktivátor NtrC – vazebné místo -140 bp Aby byl umožněn kontakt s RNAP  ohyb pomocí IHF Prokaryotický enhancer

Anti-terminace Anti-terminace jako kontrolní mechanismus Prevence terminace na specifickém místě Transkripce pokračuje Běžné u virů a pro některé bakteriální geny Anti-terminační faktor se váže na RNAP před dosažením terminačního místa

Manipulace s DNA Restrikční a modifikační enzymy Nukleázy DNA nukleázy – Dnázy RNA nukleázy – Rnázy Exonukleázy Buď 5‘ nebo 3‘ specifické exonukleázy Endonukleázy ssDNA dsDNA Specifické (restrikční enzymy) Nespecifické

Restrikční enzymy Vyvinuty jako obrana baktérie proti cizí DNA/RNA (např. viry) Vysoce specifické endonukleázy, rozeznávající 4 až 8 nt Štípou obě vlákna Mechanismus jak rozlišit svou DNA od cizí Methylace (methylázy) adeninu, nebo cytosinu v DNA sekvenci

Restrikční enzymy – typ I Rozeznávací místo tisíce bp od stěpícího místa Reakce proběhne pouze 1x ATP dependentní 3 podjednotky HsdS - DNA vazebná (rozeznává DNA sekvenci) HsdM – modifikační, methyluje DNA HsdR - enzym - štípe

Restrikční enzymy - typ II Rozeznává specifické místo, aktivita je SPECIFICKÁ Dimer Nepotřebují ATP Potřebují kofaktor (MgCl2) Palindrom (4 – 8 bází) STICKY konce vs BLUNT konce

Restrikční enzymy – typ II Hojně využívány v genetickém inženýrství Rozeznávají „ inverted repeat – PALINDROM > několik stovek enzymů Palindrom 4, 6 či 8 nukleotidů Isoschizomery: NarI BbeI EheI KasI GGCGCC CCGCGG

Restrikční enzymy – typ II Organismus Sekvence HpaI Haemophilus parainlfuenzae C/CGG NdeII Neisseria denitrificans /GATC EcoRI Escherichia coli RY13 G/AATTC EcoRV Escherichia coli J62/pGL74 GAT/ATC BamHI Bacillus amyloliquefaciens G/GATCC BglI Bacillus globigii GCCNNNN/NGGC NotI Nocardia aotidis-caviarum GC/GGCCGC DraII Deinococcus radiophylus RG/GNCCY

Restrikční enzymy – typ II BamHI 5‘ NNNNNNNG 3‘ NNNNNNNCCTAG GATCCNNNNNN 3‘ GNNNNNN 5‘

Restrikční enzymy – typ II Uplatnění sticky konců při klonování

Využití restrikčních enzymů - mapování restrikčních míst

Využití restrikčních enzymů - RFLP Restriction fragment length polymorphisms Identifikace organismu Forénzní genetika Určování otcovství

Využití restrikčních enzymů - klonování Molekulární klonování PCR Ligace do PCR vektoru Restrikční analýza Ligace do jiných vektorů Použití: KNOCK-OUT KNOCK-IN Exprese genů - proteinů

PCR vektor pGEM-T easy (Promega) XL1-Blue Genotype: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]. XL-1 cells are tetracycline resistant. XL1-Blue cells are endonuclease (endA) deficient, which greatly improves the quality of miniprep DNA, and are recombination (recA) deficient, improving insert stability. The hsdR mutation prevents the cleavage of cloned DNA by the EcoK endonuclease system. The lacIqZΔM15 gene on the F´ episome allows blue-white color screening.

Modro-bílá selekce V laboratoři při klonování Gen je klonován do lacZ genu X-gal Bílé kolonie jsou pozitivní

Ověření úspěšnosti klonování Namnožení pozitivních bílých baktérií Izolace plasmidové DNA Restrikční analýza Agarózová gelová elektroforéza Ethidium bromide (interkalační činidlo)

Ověření úspěšnosti klonování - realita PCR Klonování do PCR vektoru Klonování do specifického vektoru

Southern blot analýza Jedna z nejpoužívanějších metod molekulární biologie E.M Southern (1975) Přenos DNA molekul na membránu nylonovou nebo nitrocelulozovou membránu Identifikace specifického restrikčního fragmentu Western blot – detekce proteinů Northern blot – detekce RNA

Detekce fragmentu pomocí hybridizace Vytvoření značené (radioaktivně) próby Náhodné hexa – deca primery [-32P] dATP* dCTP, dTTP, dGTP DNAPI – Klenow fragment

Detekce fragmentu pomocí hybridizace Vytvoření značené (radioaktivně) próby Inkubace s membránou Vyvolání na rentgenový film

Důležité pojmy k zapamatování Pozitivní regulace Trp operon Negativní regulace Ara operon Alternativní sigma faktor Ko-represor Anti-terminační protein Dvousložkový regulační systém Heat shock protein cAMP Chaperon Regulon proteáza globální regulátor Anti-sigma faktor Histone-like proteiny Anti-anti-sigma faktor HU/IHF proteiny Indukční činidlo Klonování Operon Restrikční enzymy Polycistronická RNA Southern blot Lac operon Hybridizace IPTG Modro-bílá selekce