AUTOPROTILÁTKY V DIAGNOSTICE AUTOIMUNITNÍCH IMUNOPATOLOGICKÝCH ONEMOCNĚNÍ

AUTOIMUNITNÍ IMUNOPATOLOGICKÉ NEMOCI: * důsledek narušení autotolerance * poškozující zánět * orgánově specifické * orgánově nespecifické (systémové)

AUTOPROTILÁTKY: * přítomnost autoprotilátek může být příčinou nebo důsledkem autoimunitní imunopat. reaktivity * přítomnost autoprotilátek je obvykle asociována s imunopatologickým procesem * intenzita poškozujícího zánětu obvykle koreluje s množstvím autoprotilátek * namířené proti imunodominantním epitopům * častým cílem jsou multimolekulové komplexy přítomné v buňce

CAVE * existují zdravé osoby s nálezem autoprotilátek * existují pacienti s manifestní imunopatol. nemocí, u kterých nelze očekávanou autoprotilátku detegovat * přítomnost nízkých koncentrací autoprotilátek zvláště třídy IgM může být asociována s infekčním procesem * potřeba molekulově definovaných detekčních systémů (imunoblot, ELISA)

LABORATORNÍ PRŮKAZ PROTILÁTEK: založen na imunochemické detekci metodami: * imunofluorescenční mikroskopické techniky * ELISA * imunoblotové/imunodotové techniky * aglutinace, precipitace * multiplexové metody, biočipy průkaz autoprotilátek: * kvalitativní * kvantitativní: * titr * arbitrární jednotky * koncentrace

IMUNOFLUORESCENČNÍ PRŮKAZ PROTILÁTEK: Užívá se k detekci autoprotilátek reagujících s antigeny přítomnými v tkáních nebo lokalizovaných nitrobuněčně Jako substrát slouží: * orgánové řezy (orgánově-specifické protilátky) * buněčné suspenze: * Hep-2 buněčná linie (ANF) * lidské granulocyty (ANCA)

NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE Sch. 10. 49

ELISA – průkaz specifických protilátek

BLOTOVÉ TECHNIKY  Imuno-blot  Imuno-dot Slouží k přesnému průkazu specifičnosti protilátek a k analýze antigenních směsí. Jsou v podstatě kombinací elektroforézy a imunodetekce, založené na sendvičovém principu: konjugát - antilidská protilátka označená enzymem nebo radionuklidem umožňuje vizualizovat místo reakce lidské protilátky s antigenem.  Imuno-blot  Imuno-dot

ANTINUKLEÁRNÍCH AUTOPROTILÁTEK - POSTUP IMUNOBLOTOVÁ ANALÝZA ANTINUKLEÁRNÍCH AUTOPROTILÁTEK - POSTUP Sch. 10. 50

HODNOCENÍ Sch. 10. 51

IMUNODOTOVÁ ANALÝZA (např. autoprotilátek) Sch. 10. 52

Např. využití „ b i o č i p ů „ PERSPEKTIVY Trend-miniaturizace Např. využití „ b i o č i p ů „ BIOČIP nosič, kde na malé ploše (mm2) je umístěno několik desítek až stovek antigenů. Biočip je inkubován se sérem a navázané protilátky vizualizovány pomocí barevné sondy. Výsledkem je matice barevných bodů, které jsou detekovány optickým systémem a data jsou analyzována s pomocí výpočetní techniky (mikrobiologie, autoprotilátky)

IMUNOFLUORESCENČNÍ PRŮKAZ ANTINUKLEÁRNÍCH FAKTORŮ: ANTINUKLEÁRNÍ FAKTORY: * jsou autoprotilátky reagující s jaderným aparátem buňky * typicky přítomné u nemocných se systémovým onemocněním pojiva * jejich množství souvisí s aktivitou poškozujícího zánětu * mohou pronikat do buňky in vivo * modulují biologickou aktivitu nitrobuněčných molekul

ENA: extrahovatelné nukleární antigeny

ANTINUKLEÁRNÍ AUTOPROTILÁTKY U VYBRANÝCH ONEMOCNĚNÍ smíšené

ANTINUKLEÁRNÍ AUTOPROTILÁTKY U VYBRANÝCH ONEMOCNĚNÍ

NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE K PRŮKAZU ANTINUKLEÁRNÍCH FAKTORŮ

HOMOGENNÍ JADERNÁ PLAZMA difúzní fluorescence zahrnující celou jadernou plazmu antigen: DNA, histony klinická asociace: systémový lupus erythematodes, lékový lupus, revmatoidní artritida, systémová skleróza

PŘESNÉ URČENÍ REAKTIVITY ANTINUKLEÁRNÍCH FAKTORŮ * je možné v případě dostupnosti molekulově definovaných antigenů * molekulové terče pro antinukleární faktory jsou produkovány biotechnologicky * k průkazu slouží: * testy ELISA * imunoblotové techniky

METODY ANALÝZY imunoblot ELISA rekombinantní nebo purifikované antigeny

ANCA PROTILÁTKY * protilátky proti antigenům cytoplazmy neutrofilů (ANCA= antineutrophil cytoplasma antigens) * substrátem jsou etanolem nebo formalínem fixované lidské granulocyty * přítomny u nemocných s některými typy vaskulitid

* cytoplazmatická granula obsahují funkčně rozdílné makromolekuly IMUNOFLURESCENČNÍ PRŮKAZ AUTOPROTILÁTEK REAGUJÍCÍCH S CYTOPLAZMATICKÝMI GRANULAMI NEUTROFILNÍCH GRANULOCYTŮ * cytoplazmatická granula obsahují funkčně rozdílné makromolekuly * granulární proteiny se uplatňují v O2 nezávislém mechanismu usmrcování mikroorganismů * obsah cytoplazmatických granulí může být v průběhu zánětu uvolněn mimo buňku * uvolněné granulární proteiny stimulují imunitní odpověď

AUTOPROTILÁTKY ANCA A VASKULITIDY

cANCA Fluoreskuje celá cytoplazma, mnohdy jsou dobře rozlišitelná jednotlivá granula v podobě zrnité fluorescence. Jádro nesvítí. antigen: proteináza 3 přítomná v primárních granulích klinická asociace: protilátky jsou hlavním laboratorním markerem pro Wegenerovu granulomatózu. Mohou být přítomny u některých pacientů s mikroskopickou polyangiitidou, nekrotizující glomerulonefritidou nebo s Churg-Straussové syndromem

V KONTEXTU KLINICKÉHO STAVU LABORATORNÍCH UKAZATELŮ ZÁSADA: NÁLEZ AUTOPROTILÁTEK JE NUTNÉ HODNOTIT V KONTEXTU KLINICKÉHO STAVU A VÝSLEDKŮ STANOVENÍ JINÝCH LABORATORNÍCH UKAZATELŮ