Radioimunoesej, enzymoimunoesej – princip, využití Laboratorní stanovení specifických IgE protilátek Laboratorní stanovení autoprotilátek Průtoková cytometrie – princip, využití Laboratorní metody vyšetřování buněčné imunity Laboratorní metody vyšetřování humorální imunity
Stanovení humorálních analytů Precipitace Aglutinace Turbidimetrie Nefelometrie
Imunoprecipitace Srážení - proces, při němž dochází interakcí antigenu a protilátky ke vzniku (imuno)precipitátu. Vzhledem k tomu, že protilátky mají v molekule nejméně dvě identická vazebná centra pro daný antigen, mohou při vhodném koncentračním poměru obou partnerů vznikat polymerní, nerozpustné a snadno detekovatelné komplexy. Tohoto principu využívá celá řada imunochemických metod ke kvalitativnímu i kvantitativnímu stanovení antigenů nebo jim příslušných protilátek.
- vznik nerozpustného precipitátu při reakci ekvivalentních koncentrací rozpustného antigenu s rozpustnou protilátkou (tj. vzniká zesíťovaná struktura mnoha navzájem vázaných antigenů a protilátek, která již v roztoku není rozpustná)
Aglutinace Shlukování korpuskulárních částic s povrchovými antigenními strukturami v důsledku interakce se specifickou protilátkou. Antigenem jsou zde obyčejně buňky (bakterie, erytrocyty) nebo syntetické částice (např. latexové) s adsorbovanými antigeny. Tyto částice se působením protilátek shlukují a charakteristickým způsobem sedimentují; na základě vzniku zákalu lze takto stanovit i velmi nízké koncentrace protilátek (kolem 10 ng/ml). Na stejném principu fungují i citlivé testy pro stanovení antigenů.
Imunofixace vzorku séra zdravé osoby Legenda: sloupec 1: elektroforéza séra další sloupce: imunochemický průkaz jednotlivých těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů, je zřetelná polyklonální produkce
Stanovení humorálních analytů Precipitace Aglutinace Turbidimetrie Nefelometrie
ELISA – průkaz specifických protilátek Převzato - Krejsek
Základní složky ELISA testu Antigen detekovaný v testovaném vzorku známý, komerčně připravovaný Protilátka detekovaná v testovaném séru známá, komerčně připravovaná Konjugát jedná se opět o protilátku proti protilátce (konkrétně proti druhově specifickým imunoglobulinům příslušného izotypu (IgG, IgM, IgA, IgE), na kterou je navázaný enzym (konjugovaná enzymem) Substrát je chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu
RAST
ELISA – průkaz antigenu Převzato - Krejsek
Klasická 96-jamková destička pro metodu ELISA
Nepřímá imunofluorescence Převzato - Krejsek
Stanovení parametrů buněčné imunity Počty buněk – subpopulace Testy fagocytózy Testy aktivace lymfocytů
fluorochrom je konjugován s primární protilátkou - analýza plné krve - průtoková cytometrie Převzato - Krejsek
Průtoková cytometrie
http://probes. invitrogen http://probes.invitrogen.com/resources/education/tutorials/4Intro_Flow/player.html
„Gatování“ lymfocytů pomocí FS a SS
Stanovení celkových a pomocných T lymfocytů
Stanovení T a B lymfocytů
Stanovení aktivovaných lymfocytů (aktivační marker HLA-DR)
KLINICKY VÝZNAMNÉ POPULACE LEUKOCYTŮ CD3+ T lymfocyty: populace zralých T lymfocytů 50 - 75% CD4+ T lymfocyty: subpopulace pomocných induktorových T lymfocytů 30 - 60% CD8+ T lymfocyty: subpopulace tlumivých cytotoxických T lymfocytů 15 - 30% CD25+ T lymfocyty: aktivované T lymfocyty 1 - 5% CD19+ B lymfocyty: populace zralých B lymfocytů 5 - 15% CD56+ NK buňky: přirozeně zabíječské buňky 5 - 15% CD14+ buňky: monocyty CD15+ buňky: granulocyty CD38+ buňky: plazmatické buňky
FUNKČNÍ TESTY TESTOVÁNÍ FUNKCÍ T LYMFOCYTŮ IN VITRO je založeno na testování: schopnosti T lymfocytů proliferovat schopnosti T lymfocytů produkovat cytokiny PROLIFERACE T LYMFOCYTŮ: in vitro kultivace kultivační media (thymové působky) CO2 atmosféra
HODNOCENÍ FAGOCYTÁRNÍCH FUNKCÍ absolutní počet granulocytů je pro funkci fagocytózy kritický k testování fagocytózy se používají izolované granulocyty populace granulocytů je mimořádně citlivá na poškození nově lze hodnotit počty a funkce fagocytujících buněk průtokovou cytometrií
Přednášky k tématům laboratorní diagnostika AUTOPROTILÁTEK a vyšetření BUNĚČNÉ IMUNITY najdete i na webu LF HK http://www.lfhk.cuni.cz/UKIA/
ENA pokrač.