Membránový transport - mechanismy transportu malých molekul, makromolekul a experimentální transport do buňky. MUDr. Džubák Petr, Ph.D. Laboratoř experimentální medicíny při Dětské klinice Lékařská fakulta Univerzity Palackého

Doporučená a použitá literatura: Základy buněčné biologie – Alberts et al. Další zdroje: Biochemie – Voet &Voetová

Role membránových transportních proteinů

Transport molekul volnou difusí, dočasnými nebo trvalými póry, usnadněnou difusí pomocí nízkomolekulárních nebo vysokomolekulárních přenašečů nebo mechanismem endocytosy nebo exocytosy.

Propustnost lipidové dvojvrstvy Volná difuse

Klasifikace transportních proteinů 1. Póry a kanály 2. Transportéry poháněné elektrochemickým potenciálem 3. Primární aktivní transportéry 4. Skupinové translokátory 5. Transmembránové přenašeče elektronů 6. skupina 7. skupina 8. Přídatné faktory v transportních pochodech 9. Neúplně charakterizované transportní systémy Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

1. Póry a kanály 1.A α-Helikální kanály - 36 rodin Transmembránové kanálové proteiny přítomné ve všech typech buněk. Katalýza pohybu solutů ve směru jejich potenciálového nebo koncentračního spádu. Jsou obvykle složeny z α-šroubovicových transmembránových segmentů. 1.B β-Hřebenové poriny - 34 rodin Energeticky nezávislý průchod solutů přes membránu. Transmembránové části proteinů obsahují pouze strukturu skládaného listu - β-soudky. Výskyt: vnější membrány gram-negativních bakterií, mitochondrií, chloroplastů a snad i gram-pozitivních bakterií rezistentních k nízkému pH. 1.C Toxiny tvořící póry - 58 rodin peptidy resp. proteiny tvořené v jedné buňce a secernované do membrány druhé buňky, kde způsobují perforaci. Ve výsledku dochází k zániku napadené buňky způsobenému výtokem elektrolytů a malých molekul, popř. naopak vstupem toxické látky do cytoplasmy. Perforins and perforins like. 1.D Kanály syntetizované mimo ribosomy - 12 rodin Nejčastější složení: řetězce L- a D-aminokyselin, laktát a β-hydroxybutyrát. Oligomerní transmembránové kanály. 1.E Holiny - 19 rodin Podtřída obsahuje integrální membránové proteiny, které regulují vstup fágových enzymů rozkládajících buněčnou stěnu (endolysinů). Holin a endolysin je potřeba pro usmrcení bakterie způsobené bakteriofágem. Značně variabilní skupina Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

2. Transportéry poháněné elektrochemickým potenciálem 2.A Přenašeče neboli transportéry (uniportéry, symportéry, antiportéry) - 80 rodin V této podtřídě jsou zahrnuty systémy na bázi uniportu, symportu a antiportu bez využití energie chemické vazby. 2.B Přenašeče syntetizované mimo ribosomy - 6 rodin Může jít o depsipeptidy nebo sloučeniny neobsahující aminokyseliny. Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

3. Primární aktivní transportéry 3.A Přenašeče poháněné hydrolýzou vazeb P-P - 14 rodin Transportní systémy těžící z volné energie disfosfátové vazby - transport látek proti jejich koncentračnímu nebo elektrochemickému spádu. Některé proteiny jsou během transportního cyklu přechodně fosforylovány (rodiny 3.A.3 a 3.A.4). Tyto přenašeče se vyskytují ve všech doménách organismů. 3.B Transportéry poháněné dekarboxylací - 1 rodina Málo početné prokaryontní systémy využívající volnou energii dekarboxylace oxokyselin k transportu Na+. 3.C Transportéry poháněné přenosem methylové skupiny – 1 rodina Je známa jediná rodina takových přenašečů, a to z archebakterií. 3.D Transportéry poháněné oxidoredukcí – 9 rodin Systémy, kde zdrojem energie pro transport je oxidace redukovaného substrátu zprostředkovaná tokem elektronů. Vyskytují se ve všech domén•ch organismů. 3.E Světlem poháněné transportéry - 1 rodina Tato podtřída zahrnuje jedinou rodinu archebakteriálních proteinů. Homologní proteiny obsahující retinal se však vyskytují u plísní, kde mohou fungovat jako proteiny teplotního šoku, popřípadě jako molekulové chaperony. Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

4. Skupinové translokátory 4.A. Fosfotransferasové systémy - 6 rodin V této podtřídě jsou zahrnuty systémy, které katalyzují vektoriální enzymové reakce, kdy substrát je na startovní straně membrány a produkt, odlišný od substrátu, na cílové straně membrány. Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

5. Transmembránové přenašeče elektronů nově objevená skupina několika proteinů, které přenášejí elektrony pro udržení cysteinových zbytků v redukované formě, popřípadě fungují v součinnosti s oxidasami tvořícími superoxidy. 5.A Dvouelektronové transportéry - 2 rodiny 5.B Jednoelektronové transportéry Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

8. Přídatné faktory v transportních pochodech 8.A Pomocné transportní proteiny - 13 rodin Podtřída zahrnuje proteiny usnadňující transport přes biomembrány bez přímé účasti na transportu. Příkladně se jedná o tvorbu membránového komplexu, o pomoc při využití energie, nebo regulaci transportu. Klasifikace transportních proteinů Arnošt Kotyk, Chem. Listy 97, 37 - 40 (2003)

Dvě třídy transportních proteinů

Koncentrace iontů uvnitř a vně buňky se mohou lišit.

Několik příkladů transportovaných látek.

Pasivní vs. aktivní transport

Trojrozměrná struktura přenašečového proteinu bakteriorhodopsin

Trojrozměrná struktura kanálového proteinu

Kinetické schéma membránového transportu

Ionofory

Pasivní transport

Gradient elektrochemického potenciálu.

Aktivní transport

Sodno-draselná pumpa 10-30x nižší

Model čerpacího cyklu sodno-draselné pumpy

Uniport-symport-antiport

Symport – pohon aktivního transportu druhé molekuly.

Na+-glukosový symport

Osmoza

Osmotické bobtnání

Rostlinná vs. živočišná buňka

Příklady přenašečových proteinů.

Struktrura iontového kanálu

Terčíkový zámek

Proud procházející iontovým kanálem

Řízené iontové kanály

Mechanicky aktivované kanály

Distribuce iontů – membránový potenciál

Úloha K+ při tvobě membránového potenciálu.

Transportní proteiny a jejich vztah k lékové rezistenci LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Transportní proteiny a jejich vztah k lékové rezistenci P- glykoprotein (Pgp, P170) transport přes cytoplazmatickou membránu Multidrug resistance related protein (MRP 1-7) ABC transportní Breast cancer resistance protein proteiny (BCRP, MXR1, ABC-P) Lung resistance related protein nukleocytoplazmatický transport (LRP, MVP)

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE P-glykoprotein Schema struktury proteinu: U lidí kódován genem mdr1 (dlouhé raménko chromozómu 7) Nejdéle popsaný, nejznámější a dodnes klinicky nejvýznamnější protein asociovaný s MDR ATP dependentní membránová pumpa exportující toxické látky z buňky a způsobující tak sníženou intracelulární akumulaci léčiva Neprokázáno, zda se přímo uplatňuje v navození klinické rezistence, nebo zda je pouze indikátor více maligního fenotypu a tedy nepříznivým prognostickým znakem.

Rodina MRP proteinů Schema struktury proteinů: LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Rodina MRP proteinů Schema struktury proteinů: jednosměrná ATP dependentní membránová pumpa pro glutathion-S-konjugáty transportuje široké spektrum hydrofobních, záporně nabitých substrátů, nejvyšší je jeho substrátová specifita k leukotrienu LTC4 (úloha v regulaci zánětlivých procesů) MRP pozitivní pacienti mají statisticky významně vyšší riziko relapsu, kratší dlouhodobé přežití, jsou rezistentnější na deriváty platiny, Doxo, MIT-C a VP-16

BCRP protein Schema struktury proteinu: LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE BCRP protein Schema struktury proteinu: nově popsaný protein z nadrodiny ABC transportérů ABC polotransportér (aby byl funkční musí homo- či heterodimerizovat) jeho specifickým inhibitorem je Fumitremorgin C izolovaný z mikroorganismu Aspergillus fumigatus jeho exprese koreluje s klinickým průběhem onemocnění u AML pacientů s prognosticky nepříznivými cytogenetickými alteracemi, jeho zvýšená exprese by mohla být dobrým prognostickým markerem

LRP protein a organely vaults LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Struktura subcelulárních organel vaults: tvoří 70% organel vaults, kromě LRP jsou vaults tvořeny ještě ze 3 druhů minor vault proteinů a malých molekul RNA vaults jsou duté struktury, transportují toxické látky z jádra do lyzozómů, kde probíhá jejich degradace k navození MDR fenotypu je potřebná celá funkční organela vault, nikoliv pouze zvýšená exprese LRP (léčivo je inaktivováno uzavřením v organele)

Přítomnost transportních proteinů u plicního karcinomu. LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Přítomnost transportních proteinů u plicního karcinomu. MRP-1 p53 TopoIIa Pgp

LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Transportní proteiny a rezistence na nádorová léčiva – model nádorové linie CEM. DNR VCR Pgp MRP LRP CEM 0,0724 mg/ml 0,0003 mg/ml + - CEM-DNR-bulk 26x 302x +++ ++ CEM-DNR-0.3/A2 16x 707x CEM-DNR-1/D5 4x 16100x CEM-VCR-bulk 5x 626x CEM-VCR-1/F3 10x 1930x

Látky transportované proteiny MDR LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Látky transportované proteiny MDR

Používané inhibitory MDR LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Používané inhibitory MDR

Funkční aktivita transportních proteinů. LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE Funkční aktivita transportních proteinů.

volné léčivo liposomální polymerní LABORATOŘ EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY Různé formy léčiva – různý mechanismus transportu volné léčivo liposomální polymerní Ref. S.R.D. Johnston – Bussines briefing,Long term healthcare, 2004

Hematoencefalická bariéra Nature Reviews vol 6., no 8 2007, pp.650-661.

Modelování hemato-encefalické bariéry in vitro Nature Reviews vol 6., no 8 2007, pp.650-661.

Faktory ovlivňující funkci hematoencefalické bariéry. Věk Stres Nedostatek Živin Toxiny Nature Reviews vol 6., no 8 2007, pp.650-661.

Děkuji za pozornost