Primární imunodeficience Martin Liška

Imunodeficity Humorální – nespecifické - komplement specifické – imunoglobuliny (B lymfocyty) Buněčné – nespecifické – fagocytující buňky specifické – T lymfocyty Primární – vrozené, geneticky definované, projevy nejčastěji v časném věku Sekundární – projevy kdykoliv během života chronická onemocnění ozáření imunosuprese operace, trauma stres

Jiné rozdělení imunodeficiencí Poruchy fagocytózy Poruchy komplementu Poruchy protilátek Kombinované poruchy Imunodeficience s deregulací Dobře definované syndromy s imunodeficiencí.

10 varovných známek možného primárního imunodeficitu (PID) ≥ 4 nových infekcí středouší za rok ≥ 2 závažných sinusitid za rok ≥ 2 měsíce léčby ATB s malým účinkem ≥ 2 pneumonie za rok Neprospívání Recidivující abscesy kůže nebo vnitřních orgánů Perzistující soor nebo plísňové infekce kůže Potřeba léčby intravenózními ATB ≥ 2 hluboké infekce včetně sepse Rodinná anamnéza PID

Imunodeficity – kritická věková období projevů Novorozenecký věk - těžké primární buněčné imunodeficity 6 měs. – 2 roky – těžké protilátkové imunodeficity vrozené i přechodné 3 - 5 let – přechodné a selektivní protilátkové imunodeficity, sekundární imunodeficity 15 – 20 let – hormonální instabilita, involuce thymu, změny životního stylu, některé typické infekce první projevy běžného variabilního imunodeficitu Střední věk – období nadměrného pracovního zatížení, stresy první projevy autoimunit (i obraz imunodeficitu) Pozdní věk a stáří – spíše projevy vážných sekundárních imunodeficitů, následky poruchy funkce

Imunodeficity – hlavní klinické rysy Protilátky - mikrobiální infekce (opouzdřené bakterie) respirační - pneumonie, sinusitidy, otitidy GIT – průjmy Komplement – mikrobiální infekce (pyogenní), sepse postižení různých systémů otoky u HAE – deficience C1-INH T lymfocyty - bakteriální, plísňové, virové respirační – pneumonie, sinusitidy Fagocyty - abscesy, recidivující kožní hnisavé infekce granulomatozní záněty

Kazuistiky

MK *2002 ♂ Poprvé imunologicky vyšetřen v r.2004: Normální těhotenství, normální porod, normální adaptace, do 2 let stonal běžně, očkován řádně dle kalendáře BCG, tetravakcínou, HB, polio živou vakcínou, 1x živou vakcínou Trivivac, bez reakcí Ve 14. měsíci - varicella s běžným průběhem Ve 2 letech věku: recidivující protrahovaná hnisavá otitis media, bakteriologicky H. influenzae Nutná hospitalizace, opakovaná ATB léčba

Laboratorní výsledky IgG 1,89 g/l (5,9-11,7) IgA <0,11 (0,6-2,2) IgM <0,08 (0,4-1,6) CD3% 86,61 (66-76) CD3 2,19 (1,4-2,0) 109/l CD4% 54,27 (33-41) CD4 1,37 (0,7-1,1) 109/l CD8% 27,5 – v normě CD8 0,7 – v normě CD19% 0,08 (12-22) CD19 0,00 (0,3-0,5) 109/l

Laboratorní výsledky IgG 1,89 g/l (5,9-11,7) IgA <0,11 (0,6-2,2) IgM <0,08 (0,4-1,6) CD3% 86,61 (66-76) CD3 2,19 (1,4-2,0) 109/l CD4% 54,27 (33-41) CD4 1,37 (0,7-1,1) 109/l CD8% 27,5 – v normě CD8 0,7 – v normě CD19% 0,08 (12-22) CD19 0,00 (0,3-0,5) 109/l

Genetické vyšetření Prokázána mutace v genu pro Brutonovu tyrozinkinázu (BTK) Typ mutace: missense Stejný typ mutace prokázán u: - matky - babičky - prababičky (zdravé přenašečky) Bratr matky zdráv Sourozenec pacienta prenatálně geneticky vyšetřen – zdráv, bez mutace, postnatálně - normálně se vyvíjející zdravý chlapec 11 11

Diagnostický závěr: X-vázaná agamaglobulinémie (XLA)

X-vázaná (Brutonova) agamaglobulinémie (XLA) Defekt genu pro Brutonovu tyrozinkinázu (Btk)(Xq21.3-22) → blok zrání pre-B lymfocytu v B lymfocyt → neměřitelné, nebo velmi nízké hladiny Ig, snížené počty B-lymfocytů Častější X-vázaná forma, ale vzácné formy postihují i dívky Kl.obr.: projevy začínají mezi 6.měsícem a 2.rokem života: recidivující pneumonie, pyogenní otitidy s komplikacemi vyšší výskyt plicních fibróz Dg: hladiny IgG, IgA, IgM ˂ 2* SD od průměru daného věku absence izohemagulutininů a/nebo chabá serokonverze po vakcinaci výrazné snížení počtů B lymfocytů nebo jejich absence genetické vyš. Ter: celoživotní substituce IVIG

Diagnostická kritéria dle ESID X-vázaná agamaglobulinémie (XLA) Jistá dg.: Pacient mužského pohlaví s < 2% B-lymfocytů a alespoň jedním z následujících nálezů: 1) Mutace Btk 2) Chybění Btk mRNA v neutrofilech nebo monocytech 3) Chybění Btk proteinu v monocytech nebo trombocytech 4) Bratranci, strýcové nebo bratranci z matčiny strany < 2% B-lymfocytů Pravděpodobná dg.: Pacient mužského pohlaví s < 2% B-lymfocytů a všemi následujícími nálezy: 1) Recidivující bakteriální infekce v prvních 5 letech života 2) Sérové hladiny IgG, IgM a IgA o více než 2SD pod normou vzhledem k věku 3) Chybění izohemaglutininů a/nebo nedostatečná odpověď na vakcinaci 4) Vyloučení jiné příčiny hypogamablobulinémie Možná dg.: Pacient mužského pohlaví s < 2% B-lymfocytů, jemuž byly vyloučeny jiné příčiny hypogamaglobulinémie a má alespoň jeden z následujících nálezů: 1) Recidivující bakteriální infekce v prvních 5 letech života 2) Sérové hladiny IgG, IgM a IgA o více než 2SD pod normou vzhledem k věku 3) Chybění izohemaglutininů

Léčba Zahájena ihned léčba i.v. imunoglobuliny 400mg/kg 1x měsíčně, dosud Pacient odmítá zatím subkutánní léčbu Hladina IgG při této léčbě 6,0 -7,5g/l Klinicky na substituční léčbě stav velmi dobrý Nemocnost – bronchitis cca 1x za 2 roky sinusitis 1x ročně hnisavá konjunktivitis cca 1x ročně žádná pneumonie, žádné GIT potíže Plicní funkce, základní biochemické parametry včetně JT jsou trvale v normě 15 15

MK *1977 ♀ První imunologické vyšetření v r.2013: OA: v dětství časté otitidy, provedena TE RA: otec recidivující respirační infekce NO: recidivující respirační infekce (laryngitidy, faryngitidy, sinusitidy)

Laboratorní výsledky IgG 2,97 g/l (7,0-16,0) IgA <0,07 g/l (0,7-4,0) IgM <0,05 g/l (0,4-2,3) IgE < 17,1 kIU/l (0-100) IgG PCP 2,62 mg/l (≥ 15) IgG Hib 1,25 mg/l (≥ 1) IgG TAT 0,023 IU/ml (≥ 1) CD3% 77,23 (63-85) CD3 0,86 (0,8-2,2) 109/l CD4% 51,51 (31-57) CD4 0,58 (0,31-1,57) 109/l CD8% 23,97 (19-48) CD8 0,27 (0,28-1) 109/l CD19% 16,86 (7-23) CD19 0,19 (0,1-0,5) 109/l

Laboratorní výsledky IgG 2,97 g/l (7,0-16,0) IgA <0,07 g/l (0,7-4,0) IgM <0,05 g/l (0,4-2,3) IgE < 17,1 kIU/l (0-100) IgG PCP 2,62 mg/l (≥ 15) IgG Hib 1,25 mg/l (≥ 1) IgG TAT 0,023 IU/ml (≥ 1) CD3% 77,23 (63-85) CD3 0,86 (0,8-2,2) 109/l CD4% 51,51 (31-57) CD4 0,58 (0,31-1,57) 109/l CD8% 23,97 (19-48) CD8 0,27 (0,28-1) 109/l CD19% 16,86 (7-23) CD19 0,19 (0,1-0,5) 109/l

Laboratorní výsledky Naivní B-lymf.% 71,12 (58,00-72,10) B-lymf.margin.zóny % 21,48 (13,40-21,40) Izotyp.nepř.pam.B-lymf. % 3,84 (2,10-5,30) Tranzientní B-lymf. % 6,54 (1,00-3,60) Plazmablasty % 0,00 (0,60-1,60) Izotyp.přep.pam.B-lymf. % 4,27 (9,20-18,90) CD21 low % 3,41 (1,80-4,70)

Laboratorní výsledky Naivní B-lymf.% 71,12 (58,00-72,10) B-lymf.margin.zóny % 21,48 (13,40-21,40) Izotyp.nepř.pam.B-lymf. % 3,84 (2,10-5,30) Tranzientní B-lymf. % 6,54 (1,00-3,60) Plazmablasty % 0,00 (0,60-1,60) Izotyp.přep.pam.B-lymf. % 4,27 (9,20-18,90) CD21 low % 3,41 (1,80-4,70)

Diagnostický závěr: Běžný variabilní imunodeficit (CVID)

Běžný variabilní imunodeficit (CVID) Heterogenní skupina onemocnění vyznačující se výrazným snížením hladin protilátek IgG a IgA (˃2* SD od věkového průměru) v séru Připomíná XLA, ale projevy začínají obvykle až ve 2. - 3. dekádě života Kl.obraz: recidivující respirační infekty, hlavně pneumonie (Pneumokoky, Hemofily, Branhamely, Mykoplazmata), sinusitidy komplikace: nádorová nebo autoimunitní onemocnění, např. hemolytické anémie, fibrózy, endokrinopatie nebo lymfoproliferace, bronchiektázie Dg: výrazné snížení IgG+A sérokonverze po vakcinaci chabá B lymfocyty snížené až lehce zvýšené genetické vyš. (mutace genů ICOS, BAFF, CD19, CD20 a další) Ter: celoživotní substituce IVIG nebo SCIG dispenzarizace

Diagnostická kritéria dle ESID/PAGID – běžný variabilní imunodeficit (CVID) Hypogamaglobulinémie = sérová koncentrace IgG a IgA a/nebo IgM snížená o ˃ 2SD pod průměr příslušného věku Věk ≥ 2 roky Nedostatečná postvakcinační odpověď a/nebo absence izohemaglutininů (kromě pacientů s krevní skupinou AB). Vyloučení jiných příčin hypogamaglobulinémie (léky indukované, jiné vrozené imunodeficience, chromozomální vady, infekční choroby, malignity, ztráty imunoglobulinů)

Léčba Intravenózní imunoglobuliny (IVIG) – preparát Gammagard s nižším obsahem IgA (2013: anti-IgA 12,35 IU/ml (0-8)), dávka 320 mg/kg/měs. (aplikace 1x za 4 týdny) Premedikace Hydrokortison 200 mg i.v. V průběhu infúzí návaly horka, zrudnutí v obličeji, nutnost přerušení infúze → při pokračování již bez potíží Kontrolní Ig: IgG 7,95 g/l (7 - 16) IgA <0,23 g/l (0,7 - 4) IgM <0,19 g/l (0,4 - 2,3) IgE <19,1 kIU/l (0 - 100)

Další průběh Nemocnost běžná Toleruje IVIG bez premedikace (2017: anti-IgA 0,27 IU/ml) Nabídnuta možnost převodu na subkutánní imunoglobuliny (SCIG), odmítá z osobních důvodů

AB *1994 ♂ První imunologické vyšetření v r.2002: OA: častá nemocnost od nástupu do MŠ časté rýmy, sinusitis, otitis, opak. bronchitis rýma celoročně, bronchitidy spíše v zimě RA: bratr a matka polinotici SA: cihlový dům, nespí v peří, zvířata nemají, plísně ne, nekuřácké prostředí

Kožní prick testy Směs peří 0/0 Jarní pyly - břízovité 0/0 5 trav 5/15 Der. farinae 6/21 Der. pteronyssinus 5/16 Kočka 0/0 Pes 0/0 Pozitivní kontrola 0/0 Negativní kontrola 0/0 Šváb 0/0 Alternaria 0/0 Cladosporium 0/0 Směs HCD 5/9

Imunologický náběr IgG 12.81 g/l (8.5-15.5) IgA < 0.12 g/l << (1.7 – 3.5) IgM 1.48 g/l > (0.8-1.4) IgE 168.0 kIU/l >> (0-200) C3-komplement 1.32 g/l (1-1.800) C4-komplement 0.26 g/l (0.14-0.34)

Imunologický náběr IgG 12.81 g/l (8.5-15.5) IgA < 0.12 g/l << (1.7-3.5) IgM 1.48 g/l > (0.8-1.4) IgE 168.0 kIU/l >> (0-200) C3-komplement 1.32 g/l (1-1.800) C4-komplement 0.26 g/l (0.14-0.34)

Imunologický náběr IgG 12.81 g/l (8.5-15.5) IgA < 0.12 g/l << (1.7-3.5) IgM 1.48 g/l > (0.8-1.4) IgE 168.0 kIU/l >> (0-200) C3-komplement 1.32 g/l (1-1.800) C4-komplement 0.26 g/l (0.14-0.34) přesnější stanovení hladiny IgA pomocí RID: 23 mg/l

Diagnostické závěry Selektivní deficit IgA Alergie na pyl trav a roztoče

Diagnostická kritéria – selektivní deficit IgA (SIAD) Nejrozšířenější PID (v Evropě incidence 1/500-700) Nemusí mít žádné klinické příznaky, ale většina těchto pacientů trpí zvýšenou náchylností k respiračním infektům a k alergickým a autoimunitním chorobám Při podání transfúze je vhodná autotransfúze, event.proprané erytrocyty Diagnostika: jistá dg. = (pacient starší 4 let, sérová koncentrace IgA < 0.07 (0.05)g/l, normální koncentrace IgG+M pravděpodobná dg. = (sérová koncentrace IgA > 2 SD od průměru, jinak jako výše uvedené)

Léčba Nasazeno antihistaminikum (loratadin) a topické kromony (nagtrium kromoglykát) Jinak bez léčby, poučení o transfúzi

Laboratorní diagnostika

RIA – radioimunoanalýza Princip: Ag nebo Ab se značí radioaktivním izotopem (rozdíl od metody EIA) → následně označen IK vysoká citlivost a specifičnost nevýhoda: vyšší nároky na technické vybavení, bezpečnost práce Použití: stanovování hladin některých hormonů, TU markerů (Oddělení imunochemické diagnostiky FN Bory)

EIA – Enzyme ImmunoAssay Dělení EIA metod: a) dle typu enzymu, substrátu a detekce výsledného produktu: ELISA (fotometrická detekce barevného produktu) FEIA (fluorometrická detekce fluorescence výsledného produktu) LEIA (luminometrická detekce světla uvolněného při změně chemické struktury substrátu) b) dle postupu: heterogenní x homogenní kompetitivní x nekompetitivní

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay = heterogenní nekompetitivní sandwichová ELISA vícevrstevná (sandwichová) metoda – analyt (Ag nebo Ab), je vázán mezi dvěma vrstvami: Ab-Ag-Ab* nebo Ag-Ab-Ab*

EIA – enzyme immunoassay ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Princip: pevná fáze je pokryta např. Ag → přidáme vzorek s hledanou Ab → tvorba IK (Ag - Ab) → promytí → přidáme konjugát, tzv. „sekundární Ab“ → vzniká komplex Ag-Ab-Ab* → promytí → přidán substrát → enzymatická reakce → vznik barevného produktu

ELISA Hodnocení ELISA: fotometr měří absorbanci (intenzitu zbarvení) vzniklého barevného produktu. Intenzita zbarvení je přímo úměrná koncentraci vyšetřovaného vzorku a příslušná hodnota se odečítá pomocí kalibrační křivky

FEIA - FluoroEnzymoImunoAnalýza výsledkem reakce je fluoreskující produkt, který je měřen fluorometrem použití: např. stanovení specifických IgE  FEIA - FluoroEnzymoImunoAnalýza LEIA - LuminoEnzymoImunoAnalýza výsledkem reakce je změna chemické struktury substrátu → způsobí uvolnění fotonů → světélkování → měřeno luminometrem použití: stanovení hladin specifických IgE, ECP, některých hormonů, TU markerů atd.

ELISA – průkaz specifických protilátek Převzato - Krejsek

ELISA – průkaz antigenu Převzato - Krejsek

Klasická 96-jamková destička pro metodu ELISA

Laboratorní stanovení specifických IgE protilátek - in vitro metoda využívaní v diagnostice alergií in vivo metoda využívaná k diagnostice alergií jsou kožní testy Účelné indikace vyšetření specifických IgE: nelze provést kožní testy (gravidita, nespolupracující pacient, nelze vysadit antihistaminika) kožní testy nelze provést v důvodu kožní choroby (atopický ekzém) diskrepance mezi kožními testy a anamnestickými údaji Interpretace výsledků: vysoká hladina celkového IgE může způsobit falešnou pozitivitu specifických IgE

Detekční systémy: systém CAP- fluorescenční detekce systém Immulite- chemiluminiscence Multiplexové metody - fluorescenční detekce

Laboratorní diagnostika Singlplexové metody Vysokoafinitní fluoroenzymoimunoanalýza Na sekundarni protilátce je navazan enzym beta galactosidasa, je stepena substrátem za vzniku fluorescence

Laboratorní diagnostika Singlplexové metody Chemiluminiscenční enzymová imunoanalýza Enzym alkalicak posfataza je stepena subratem fosfat ester adamantyl dioxetan za vzniku chemiluminescencniho signalu.

Laboratorní diagnostika Multiplexové metody – ISAC Semi-kvantitativní metoda Solid-phase immunoassay 112 komponent ISU jednotky 0,3–100 ISU-E MIA software excitace 532 nm Solid phase imunoasay, komponenty jsou imobilizovany na pevnem substratu v microaraovem formatu, které reaguji se specifickými IgE v pacientskem seru, po domyti se odmyji nespecificke Ige, pote se prida fluorescencne znacena anti lidska Ige a vytvori se komplex. Po inkubaci a po promyti se odmyji nenavazane znacene anti Ige, anylyzvano je to Using a standard calibration curve, results are reported within a range of 0.3 - 100 ISAC Standardized Units (ISU-E) • giving a semi-quantitative indication of IgE antibody levels ISAC results for some allergen sources such as cashew nut, sesame, dog, mugwort, and ragweed can be negative, even when the extract-based test is positive  triggering allergen is not present on the chip

Laboratorní diagnostika Multiplexové metody – ALEX Kolorimetrická enzymová analýza Solid-phase immunoassay Kvantitativní metoda – sIgE 0,1–50 kUA/L Semikvantitativní metoda – tIgE 1-2500 ku/L >100 komponent a >150 extraktů MADx Raptor software Macroskopic array Extrakty a komponenty jsou navazany na ¨nanočástice, ty jsou navazany na pevny nosic a vse dohroma tvori makroaraevy format. jsou imobilizovany na pevne fazi v makroarayovem formatu. Po druhem promyti je pridam substrat který reakci s enzymem navazanym na protilátce anti IgE vytvori nerozputny zabarveny precipitat. Mnozstvi precipitatu je primo umerne koncentraci specifických IgE v pacientkem seru. Pote se cip vlozi do Image explorer pristroje

Stanovení specifických antimikrobiálních protilátek, cytokinů a mediátorů v laboratoři ÚIA IgG PCP (ELISA) IgG Hib (ELISA) ECP (Immulite) Tryptáza (UniCap) IL-6 (Immulite)