Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně Miroslav Votava MIKROBIÁLNÍ BIOFILM Přednáška pro II. r. VL 12.3.2009

Dvě formy mikrobiálního růstu 1. RŮST VE FORMĚ PLANKTONICKÉ navzájem izolované mikrobiální buňky se volně vznášejí v tekutém prostředí 2. RŮST VE FORMĚ BIOFILMU dán přirozeným sklonem mikrobiálních buněk lepit se k sobě navzájem a na pevný povrch a vytvářet společenství spojené mimobuněčnou hmotou

Která forma růstu je častější? Forma planktonická zcela běžná v laboratoři (např. v bujonu) v přirozeném prostředí poměrně vzácná Forma biofilmu základní a rozhodující v přirozeném prostředí je pro mikroby výhodnější

Definice biofilmu MIKROBIÁLNÍ BIOFILM JE SPOLEČENSTVÍ MIKROBŮ, KTERÉ SE TVOŘÍ NA ROZHRANÍ FÁZÍ LNE K INERTNÍM I ŽIVÝM POVRCHŮM JE ULOŽENO V MEZIBUNĚČNÉ HMOTĚ, V NÍŽ VZNIKÁ SPLETITÝ SYSTÉM KANÁLKŮ

Tři příklady biofilmu Uklouzli jste někdy na mokrých kamenech v potoce? Určitě ano – a to jste uklouzli právě na biofilmu Máte akvárium a čistíte jeho stěny? Pokud ano, stíráte z nich biofilm tvořený řasami Čistíte si pravidelně zuby? Pakliže ano, odstraňujete z nich biofilm zvaný zubní povlak

Historie biofilmu 1676 Antony van Leeuwehoek 1935 C. E. Zobel bakterie v zubním plaku 1935 C. E. Zobel první popis biofilmu u mořských bakterií 1950 – 1960 první zprávy o problémech s biofilmem 1978 J. W. Costerton upozornění na všudypřítomnost biofilmu 1999 Costerton, Stewart  Greenberg účast biofilmu v perzistentních infekcích

Mikrobiologie na scestí – 1 100 let od dob Pasteura a Kocha nikoho nenapadlo, že bakterie v přírodě rostou jinak, než jako volně se vznášející plankton v mořích nebo jako kolonie na agaru Od poloviny 19. do poloviny 20. století po celý „zlatý věk bakteriologie“ se studovaly jen planktonické formy Pokud se objevily známky růstu v podobě biofilmu, byl pokus rychle „kanalizován“

Mikrobiologie na scestí – 2 Celá mikrobiologie byla uvedena v omyl snahou vyšetřovat a zkoumat čisté kultury planktonicky rostoucích buněk, zatímco pro mikroby je přirozené růst jako biofilm Poslední oblastí mikrobiologie, která se začala biofilmem zabývat, je bohužel mikrobiologie lékařská, pyšná na úspěchy dosažené s planktonickými formami

Vývoj biofilmu = cyklický proces Jak vzniká biofilm? Vývoj biofilmu = cyklický proces Přitahování planktonických buněk k povrchu (atrakce) 2. Přichycení planktonických buněk (adhese) 3. Vznik mikrokolonií (agregace) – fenomén quorum-sensing 4. Tvorba exopolysacharidové matrix (slizu) (akumulace) – vznik typické architektury 5. Odlučování buněk z povrchu biofilmu (disperse)

Vývoj biofilmu – atrakce Nejde jen o přitahování k pevnému povrchu, ale obecně k rozhraní fází (k hladině) Nápadné u pohyblivých bakterií s bičíky Jak bakterie pozná, že je blízko povrchu? Vysílá chemické signály, které difundují rychleji do volných oblastí, kdežto v blízkosti rozhraní fází se koncentrují

Vývoj biofilmu - adhese Přehled bakteriálních adhesinů fimbrie (pili) kolonizační faktory enteropatogenních kmenů E. coli proteiny a lipopolysacharidy zevní membrány obecně u většiny gramnegativních bakterií sliz koagulasanegativní i zlaté stafylokoky curli E. coli

Vývoj biofilmu – agregace I 1. Pohyb pomocí bičíků (E. coli, Vibrio cholerae) pomocí fimbrií (pili typu IV Pseudomonas aeruginosa) od sebe – vzniká souvislá vrstvička buněk k sobě – vznikají agregáty, a to i z odlišných druhů (např. koagregace Streptococcus gordonii + Fusobacterium nucleatum v zubním povlaku) 2. Množení jak agregací, tak dělením buněk v agregátech vznikají mikrokolonie

Vývoj biofilmu – agregace II 3. Quorum sensing Během množení vysílají jednotlivé buňky chemické signály (homoserinlaktony u P. aeruginosa) Po dosažení určitého počtu buněk (tzv. kvorum) zvýšená koncentrace signálů vyvolá změnu vlastností buněk: - vypojení některých dosud účinkujících genů (např. pro flagelin) - expresi genů jiných a z toho plynoucí - tvorbu nových produktů (zejména exopolysacharidů)

Vývoj biofilmu – akumulace Tvorba exopolysacharidů kyselina kolanová (E. coli) alginát (P. aeruginosa) polysacharidový intercelulární adhesin (Staph. epidermidis) vede ke vzniku typické architektury biofilmu její vzhled závisí hlavně na charakteru prostředí

Vývoj biofilmu – disperse Po dosažení kritického množství biomasy nebo po snížení množství živin v prostředí se mění charakter buněk při povrchu biofilmu např. u P. aeruginosa povrchové buňky - přestávají tvořit alginát - začínají tvořit lyasu a flagelin povrchová vrstva biofilmu se začíná rozpadat buňkám narůstají bičíky a buňky se uvolňují z biofilmu Buňky jako planktonická populace odplouvají hledat vhodnější prostředí a kolonizovat nové povrchy Kruh se uzavírá…

Architektura biofilmu – I závisí především na koncentraci živin <10 mg/L (horské potoky, jezera, moře) heterogenní mozaika (vrstvička + sloupečky mikrokolonií) 10-1000 mg/L (většina našich řek a rybníků) komplexní systém s kanálky (tvořený houbovitými, částečně splývajícími mikrokoloniemi) 1000 mg/L (v prostředí makroorganismu) kompaktní biofilm (téměř beze stop po kanálcích)

Architektura biofilmu – II nízké koncentrace živin (0,1 – 10 mg/L – horské potoky, jezera, moře) heterogenní mosaika = tenká vrstvička jednotlivých buněk z ní sem tam vyčnívají sloupcovité mikrokolonie

Architektura biofilmu – III střední koncentrace živin (10 – 1000 mg/L – eutrofní vodní prostředí) systém s kanálky = navzájem částečně splývající mikrokolonie houbovitého tvaru protkané vodními kanálky

Architektura biofilmu – IV

Architektura biofilmu – V vysoké koncentrace živin (>1000 mg/L – prostředí v makroorganismu) kompaktní biofilm = těsně související četné mikrokolonie téměř beze stop po případných kanálcích polymikrobiální = zubní plak, normální mikroflóra sliznic

Architektura biofilmu – VI vysoké koncentrace živin (>1000 mg/L – prostředí v makroorganismu) kompaktní biofilm = těsně související četné mikrokolonie téměř beze stop po případných kanálcích b) monomikrobiální = např. chronická osteomyelitis biofilm na inertním povrchu lékařských pomůcek

Architektura biofilmu – VII Biofilm Candida albicans. Alciánová modř zbarvila extracelulární polysacharidy. Snímek: Veronika Holá

Architektura biofilmu – VIII Biofilm Candida albicans. Toluidinová modř. Na snímku je dobře patrna houbovitá struktura biofilmu. Snímek: Veronika Holá

Vlastnosti biofilmu – 1 jde o vyšší a složitější způsob mikrobiálního růstu využívá možností vzájemné spolupráce buněk umožňuje snazší přenos genů vyznačuje se účinnou homeostázou vykazuje rysy primitivního oběhového systému poskytuje vysokou ochranu před antimikrobiálními činiteli uplatňuje se v řadě prakticky důležitých situací včetně lékařsky významných stavů

Mikroby rostoucí v podobě biofilmu Vlastnosti biofilmu – 2 Shrnutí: Mikroby rostoucí v podobě biofilmu mají vlastnosti zásadně odlišné od vlastností mikrobů rostoucích ve formě planktonické exprimují jiné geny tvoří jiné produkty (extracelulární hmota  bičíky) požívají vyšší stupeň ochrany

Význam biofilmu pro mikroby – I Výhodnější prostředí pro život mikrobů možnost účinné kooperace a specializace buněk stálá vzájemná poloha buněk různých druhů v mezibuněčné hmotě a odpovídající přítomnost různých enzymů mnohem snadnější přenos genů účinná homeostáza uvnitř aerobně vzniklého biofilmu mohou být místa anaerobní primitivní oběhový systém přináší a odnáší živiny, odpadní látky i signální molekuly

Význam biofilmu pro mikroby – II Ochrana před nepříznivými vlivy v prostředí: před amébami, fágy, vysycháním, odplavením, toxickými látkami v makroorganismu: před fagocyty, odplavením, komplementem, protilátkami, antibiotiky

Rezistence biofilmu vůči toxickým látkám MIKROBY V PODOBĚ BIOFILMU JSOU VŽDY ODOLNĚJŠÍ NEŽ FORMY PLANKTONICKÉ zvýšená odolnost se týká i dezinfekčních látek a antibiotik rozdíly v citlivost činí někdy až 3 řády obecný mechanismus zvýšené rezistence není znám u každé kombinace mikrob-antimikrobiální látka může být jiný

Možné příčiny zvýšené rezistence biofilmu Zhoršený průnik toxické látky biofilmem Změněný charakter prostředí v biofilmu Změněná mikrobiální populace v biofilmu

EXTRACELULÁRNÍ MATRIX JAKO Zhoršený průnik EXTRACELULÁRNÍ MATRIX JAKO PENETRAČNÍ BARIÉRA zhoršená difuse antimikrobiální látky logické vysvětlení nelze však vždy prokázat vliv povrchového náboje zdá se důležitější např. aminoglykosidy (+) se vážou na alginát (-) P. aeruginosa

MÍSTNÍ ZMĚNY V PROSTŘEDÍ BIOFILMU MAJÍ NA PŮSOBENÍ ANTIBIOTIKA Změněné prostředí MÍSTNÍ ZMĚNY V PROSTŘEDÍ BIOFILMU - spotřebování O2 v určitých oblastech - zvýšení osmotického tlaku - nahromadění kyselých zplodin metabolismu MAJÍ NA PŮSOBENÍ ANTIBIOTIKA přímý vliv - potlačení účinku antibiotika chinolony, aminoglykosidy nepřímý vliv - snížení růstové rychlosti beta-laktamy, glykopeptidy

Změna mikrobiální populace běžná dávka toxické látky zabije 99 % mikrobů v biofilmu zůstane subpopulace buněk k dané látce vysoce rezistentních není jasné, zda existovala od začátku, nebo zda vznikla až vlivem toxické látky tato subpopulace odpovídá za zvýšenou rezistenci biofilmu

BIOFILM SE UPLATŇUJE V PATOGENEZI Biofilm a onemocnění – 1 BIOFILM SE UPLATŇUJE V PATOGENEZI CHRONICKÝCH INFEKCÍ OBECNĚ INFEKCÍ IMPLANTOVANÝCH POMŮCEK tyto procesy probíhají pomalu bez výraznějších příznaků občas akutně exacerbují antibiotická terapie mívá efekt jen časově omezený po vysazení antibiotik infekce rekurují (i když bakterie z nich vypěstované se in vitro jeví být citlivé)

1. CHRONICKÉ INFEKCE PŘIROZENÝCH TĚLESNÝCH POVRCHŮ Biofilm a onemocnění – 2 1. CHRONICKÉ INFEKCE PŘIROZENÝCH TĚLESNÝCH POVRCHŮ zubní kaz (viridující streptokoky) periodontitis (gramnegativní ústní anaeroby) otitis media (Haemophilus influenzae) osteomyelitis (Staphylococcus aureus) záněty žlučníku a žlučových cest (enterobakterie) prostatitis (Escherichia coli) subakutní bakteriální endokarditida (viridující streptokoky) zánět plic při cystické fibróze (Pseudomonas aeruginosa)

2. CHRONICKÉ INFEKCE UMĚLÝCH POVRCHŮ Biofilm a onemocnění – 3 2. CHRONICKÉ INFEKCE UMĚLÝCH POVRCHŮ centrální venosní katétry (koagulasaneg.stafylokoky, kandidy) umělé srdeční chlopně (Staph. aureus, Staph. epidermidis) kloubní náhrady (Staphylococcus aureus, Staph. epidermidis) chirurgické stehy (Staph. aureus, Staph. epidermidis) cévní štěpy (grampozitivní koky) endotracheální kanyly (rozmanité bakterie a kvasinky) nitroděložní tělíska (Actinomyces israelii) močové katétry (E. coli a další, většinou gramnegativní tyčinky) kontaktní čočky (Pseudomonas aeruginosa, grampozitivní koky)

Možnosti ovlivnění biofilmu – I 1. PREVENTIVNÍ – PŘEDCHÁZENÍ VZNIKU BIOFILMU nyní: ovlivnění povrchu biomateriálů (změna náboje) impregnace biomateriálů antimikrobiálními látkami (antibiotika, antiseptika) v budoucnu: interference se signály typu quorum-sensing inhibice tvorby mimobuněčné hmoty inhibice vzniku vysoce odolných perzistorů

Možnosti ovlivnění biofilmu – II 2. ROZRUŠENÍ JIŽ PŘÍTOMNÉHO BIOFILMU nyní: vysoká koncentrace antimikrobiální látky – tzv. antibiotická zátka v žilním katétru kombinace antimikrobiálních látek s rozdílným mechanismem účinku rozvolnění mezibuněčné hmoty – např. enzymaticky (lyasy polysacharidů) v budoucnu: využití molekul vyvolávajících autodestrukci biofilmu

BIOFILM V MAKROORGANISMU HRAJE I PROSPĚŠNOU ROLI Biofilm a zdraví BIOFILM V MAKROORGANISMU HRAJE I PROSPĚŠNOU ROLI naše sliznice jsou povlečeny biofilmem normální mikroflóry (zejména sliznice tlustého střeva, nosohltanu, pochvy) to jim poskytuje poměrně účinnou ochranu před uchycením patogenů - tlusté střevo: nesporulující anaeroby - nosohltan: viridující streptokoky - pochva: laktobacily

Problémy s biofilmem mimo medicinu Znečištění povrchů Zvýšení turbulence proudící tekutiny Zúžení průsvitu až ucpání potrubí Koroze ropovodů, nádrží paliva v letadlech Černání tekutin redukovanými kovy Izolační vrstva v tepelných výměnících Odpor lodního trupu při plavbě a mnohé další

Souhrn Biofilm je přirozeným způsobem růstu mikrobů Jde o společenství mikrobů uložené ve strukturované mezibuněčné hmotě Biofilm pevně lne k pevným povrchům Jeho struktura závisí na množství živin v prostředí Je výhodnější pro mikroby po stránce metabolické i jako ochrana před nepříznivými vlivy Mikroby v biofilmu mají odlišné vlastnosti Biofilm přináší problémy v řadě oborů Zbavit se biofilmu je nesnadné

Česká literatura o biofilmu Schindler, J.: Mikrobiální biofilm. Vesmír 80, 2001, 203-206 Votava, M.: Mikrobiální biofilm a jeho význam v lékařství. Prakt. Lék. 82, 2002, 522-525

Doporučená literatura Paul de Kruif: Lovci mikrobů Paul de Kruif: Bojovníci se smrtí Alarich: Medicina v županu Axel Munthe: Kniha o životě a smrti I nadále prosím o příklady další beletrie v souvislosti s medicínou vůbec a mikrobiologií zvlášť. Tyto příklady a případné dotazy zasílejte na adresu mvotava@med.muni.cz Děkuji, že jste mne sledovali