Genetický podklad komplexních nemocí 9.4.2009

Genom ve zdraví a nemoci Genetická výbava jedince (souhrn všech genů=genom) je sice osudově zadána v okamžiku zplození, ale není pro další život konečná, protože v průběhu života se může měnit jak pod vlivem četných faktorů prostředí, tak pod vlivem dalších faktorů epigenetických.

Genové mutace Z hlediska patogeneze nemocí je důležité, zda se jedná o mutace v somatických buňkách, které vznikají v průběhu života, většinou jsou buněčně nebo tkáňově specifické a nepřenášejí se na potomstvo, nebo zda jde o tzv. zárodečné mutace, které vznikají v zárodečných buňkách (vajíčko nebo spermie), stávají se součástí vrozené genetické predispozice, jsou obsaženy ve všech buňkách a přenášejí se na potomstvo. Mutací vzniklé alely jsou v populaci z různých důvodů vzácné (např. jsou výrazně patologické a tudíž jsou z populace odstraňovány selekcí, nebo vznikly nedávno a nestačily se v populaci rozšířit) a časté (polymorfismy).

Polymorfismy v DNA Jako polymorfismy v DNA se označují přirozeně se objevující změny v sekvenci DNA s více než jednou variantou-alelou, s populační frekvencí více než 1 %. Objevují se v průměru jednou na každých 1000 párů bází genomové DNA. Asi 90 % z nich jsou polymorfismy se záměnou jednoho nukleotidu (single nucleotide polymorphisms - SNP), jejichž podstatou je substituce jedné báze. Většina těchto polymorfismů leží v nekódujících (intronových) sekvencích, na jejichž funkční význam existují odlišné názory.

Polymorfismy v DNA Kromě SNP se vyskytují také minisatelitní a mikrosatelitní polymorfismy, které vznikají v důsledku variace v  tzv. tandemových repetitivních sekvencích. Minisatelitní polymorfismy jsou obvykle dlouhé 0,1-20 kilobází, zatímco mikrosatelitní často méně než 100 párů bazí. Ačkoliv většina polymorfismů je zřejmě funkčně neutrální, část z nich zřejmě má alelicky specifické účinky na regulaci genové exprese nebo funkce kódovaného proteinu, což determinuje interindividuální variabilitu v biologických znacích i vnímavost vůči nemoci.

Komplexní (multifaktoriální, multigenní) nemoci Za genetickou predispozici mnoha biologických procesů, evolučních adaptací a tedy také tzv. komplexních nemocí zřejmě odpovídají kombinace určitých genů a určitých faktorů zevního prostředí. Interakční efekty a vliv vnějších faktorů však nutně musíme očekávat i v případě mendelisticky děděných nemocí, což se koneckonců projevuje ve všeobecně známé lékařské zkušenosti se  širším klinickým spektrem příznaků stejného onemocnění.

Komplexní (multifaktoriální, multigenní) nemoci Na odhalení nejobecnějších principů genetiky multifaktoriálních nemocí se na rozdíl od genetiky nemocí mendelistických v současné době stále ještě čeká. Také z tohoto důvodu zatím v klinické praxi často kolísá názor na výsledky genetických studií, které se snaží odhalit genetický podklad komplexních nemocí, od neodůvodněného očekávání nad nalezenými geny velkého účinku až po velkou skepsi vzhledem k existenci genetického podkladu v populaci četných nemocí ( nad 1%), jako je v kardiologii např. esenciální hypertenze. Jisté je, že pokud choroba má prokazatelně familiární výskyt, musíme očekávat podíl genetického podkladu na její manifestaci, a to i v tom případě, že není dosud dobře definován nebo dosavadní znalost nepovažujeme za přesvědčivou.

Komplexní (multifaktoriální, multigenní) nemoci Jinak řečeno, v 21. století již musíme počítat s tím, že fakticky každá choroba má nějaké genetické pozadí, jehož podíl na manifestaci dané choroby je různý. Své genetické pozadí mají i tak relativně vzdálené proximální fenotypy (viz níže), jako je např. kvalita života u nemocných s chronickým kardiovaskulárním onemocněním.

Genetické studie Základní debata nad genetickým podkladem nemocí logicky začíná od strategie výběru kandidátních genů. Tato otázka je podstatně jednodušší u mendelisticky děděných nemocí, kde se změněná funkce jednoho genu snadněji identifikuje. Dalším významným momentem je výběr statistické metodologie, která zhodnotí sílu asociace genů s chorobami. Možnosti jsou v zásadě dvě: linkage (vazebná) analýza a asociační studie. K detekci specifických genetických oblastí a genů, které se účastní v transmisi nemoci, je v principu možné použít obě metody.

Genetické studie Asociační studie vyšetřují souvýskyt markeru a nemoci na populační úrovni, tj. u nepříbuzných jedinců, obvykle srovnáním frekvencí markerů u nepříbuzných nemocných a kontrolních subjektů (studie case-control). Statistickou sílu asociace je možno dále zvýšit obohacením o další kritéria, jako jsou klinické subtypy nemoci (studie case-case), závažnost nemoci, časný začátek nemoci, rizikové faktory pro nemoc včetně pohlaví a vhodné biologické znaky (např. plasmatické hladiny cytokinů při asociaci genetických polymorfismů v cytokinových genech; studie genotyp-fenotyp).

Kandidátní geny - asociace s intermediálním fenotypem s klinickou manifestací nemoci s klinickou závažností nemoci s odpovídavostí nemoci na léčbu (účinnost, vedlejší příznaky)

Výběr kandidátních genů pro komplexní nemoci Základní fyziologické/patofyziologické děje: Hypoxie Hypoglykémie Zánět

Chow et al., 2007

Clark, I. M., et al., The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors, Int J Biochem Cell Biol (2008), doi:10.1016/j.biocel.2007.12.006

Clark, I. M., et al., The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors, Int J Biochem Cell Biol (2008), doi:10.1016/j.biocel.2007.12.006

Chow et al., 2007

Cíle pro MMP-2 po poškození typu ischémie/reperfúze Chow et al., 2007 Kardiomyocyty Myosin light chain Cíle pro MMP-2 po poškození typu ischémie/reperfúze Chow et al., 2007

Chow et al., 2007

William Hornebeck and François Xavier Maquart, 2003 RGD=LEUCINE-RICH REPEAT-, TROPOMODULIN DOMAIN-, AND PROLINE-RICH DOMAIN-CONTAINING PROTEIN William Hornebeck and François Xavier Maquart, 2003

Kolagenem (-y) řízený β1–β3 „switch“ a regulace buněčné migrace Kolagen typu IV: akce MMP-2, MMP-9 (nebo jiných enzymů) odkrývá místa na kolagenu typu IV, která reagují s vβ3 a podporují buněčnou migraci. Extenzivnější proteolýza vede k uvolnění peptidu 3CB IV, který inhibuje prostřednictvím interakce s β3 buněčný růst a migraci (down-regulation MT1-MMP a vβ3). Kolagen typu I: interakce řízená 2β1 mezi tímto typem kolagenu a buňkami melanomu indukuje expresi MMP-1, MT1-MMP a aktivaci MMP-2; tyto enzymy mohou spolupracovat na degradaci kolagenu.

Gen pro MMP2 – lokalizace 16q13 Promotor genu -735 C T 0.12

MMP-2 (-1306 A/G) Tranzice C --> T v pozici -1306 (alelická frekvence 0.26), která mění promotorové místo Sp1-typu (CCACC box), způsobuje nižší promotorovou aktivitu alely T (Price et al., 2001) p16 oslabuje Sp1 vazbu na promotor MMP-2 a suprimuje transkripci genu. Zvýšená exprese Sp1 může hrát proti této p16-indukované snížené expresi MMP-2. Komplex cyklinA/CDKináza může přímo fosforylovat Sp1 a podporovat jeho vaznou aktivitu na DNA (Wang et al., 2006)

MMP-2 (-790 T/G) Alela T, nikoliv G obsahuje sekvenci 3 transkripčních faktorů: GKLF (gut-enriched Krueppel-like factor) Účastní se proliferace a diferenciace tkání Knockoutované myši těžké malformace str. corneum Účast v patogeneze mnohočetného myelomu (zvýšeně exprimován při blokádě receptoru 3 pro fibroblastový růstový faktor in vitro) Umlčován v buňkách „adult T-cell leukemia“ S8 Povrchový antigen Evi1(ectopic viral integration site 1 encoded factor) Inhibuje signální dráhu cytokinů rodiny TGF a tím i apoptózu navozovanou TGF  změněná (zvýšená) exprese u lidských myelodysplastických syndromů a jiných hematologických malignit

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární MMP-2-1575 G/A NS

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární MMP-2 -1306 T/C NS

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární MMP-2 -790 G/T Pg=0,01, Pa=0,03 Pg=0,007, Pa=0,009 Pg=0,02, Pa=0,009 Pg=0,01, Pa=0,02

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární MMP-2 -735 T/C NS

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární Chronické srdeční selhání a celkový cholesterol ATGT : OR=14,3; P=0,00075 – Pcorr=0,006 Síla testu– 85% při = 5% Dostatečná velikost souboru

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární DILATAČNÍ KARDIOMYOPATIE MMP2 a celkový cholesterol GCTT: OR=8,75, P=0,01 pro DKMP s vysokou hladinou cholesterolu ATGT: OR=0,12, P=0,03 pro DKMP s vysokou hladinou cholesterolu

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární DILATAČNÍ KARDIOMYOPATIE VS MMP-2 a nemoci kardiovaskulární DILATAČNÍ KARDIOMYOPATIE VS. ISCHEMICKÁ CHOROBA SRDEČNÍ MMP2 a celkový cholesterol pod 5 mmol/l GCTT: OR=11, P=0,002 pro ICHS oproti DKMP, 80% síla testu na  = 5% ATGT: OR=11,92, P=0,008 pro DKMP oproti ICHS, 65% síla testu na  = 5%

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární CHRONICKÉ SRDEČNÍ SELHÁNÍ MMP2 a LDL GCTC : P=0,02

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární Haplotyp ATGT čtyř promotorových polymorfismů v genu pro MMP-2 nese vysoké riziko (OR=14, Pcorr=0,006) pro pacienty chronickým srdečním selháním a nízkou hladinou cholesterolu oproti pacientům s vysokou hladinou cholesterolu. Haplotyp ATGT nese vysoké riziko (OR=9, P=0,01) pro pacienty s dilatační kardiomyopatií a nízkou hladinou cholesterolu oproti pacientům s vysokou hladinou cholesterolu. Neprokázali jsme asociaci žádného haplotypu v promotoru genu pro MMP-2 s ischemickou chorobou srdeční a nízkou nebo vysokou hladinou celkového cholesterolu.

MMP-2 a nemoci kardiovaskulární Haplotyp ATGT nese zvýšené riziko (OR=12, P=0,008) pro srdečně selhávající pacienty s dilatační kardiomyopatii oproti pacientům s ischemickou chorobou srdeční. Haplotyp GCTT nese naopak vyšší riziko (OR=11, P=0,002) pro pacienty s ICHS oproti srdečně selhávajícím pacientům s dilatační kardiomyopatií. Haplotyp četných promotorových polymorfismů jsme asociovali pouze s celkovou hladinou cholesterolu, nikoliv s dalšími parametry lipidového metabolismu.

MMP-2 a kožní T-lymfomy Pg=0,06, Pa=0,04, odds ratio pro CC u MF, SS=3,29, Pcorr=0,05

MMP-2 a kožní T-lymfomy Pg=0,01, Pa=0,009, odds ratio pro TT u MF, SS=3,25, Pcorr=0,05

MMP-2 a kožní T-lymfomy Pg=0,02, Pa=0,008, odds ratio pro GG u MF Ia=4,80, Pcorr=0,03

MMP-2 a kožní T-lymfomy Pg=0,009, Pa=0,007, odds ratio pro CC u MF Ia=7,31, Pcorr=0,008

MMP-2 a kožní T-lymfomy Pg=0,007, Pa=0,003, odds ratio pro TT u MF Ia=7,77, Pcorr=0,006

MMP-2 a kožní T-lymfomy

Phillips MI et al., 2008

Patofyziologické souvislosti mezi genetickou variabilitou v ATG Reakce akutní fáze a ateroskleróza? Reakce akutní fáze a rakovina? Reakce akutní fáze a autoimunita?

Frekvence 7 haplotypových skupin v genu pro ATG definovaných 19 polymorfismy -1074 -812 -792 -775 -532 -217 -6 68 172 384 409 507 676 698 1164 2186 4072 5093 5593 Frequency Percentage H1 T C A G 17 16.3 H2 12 11.5 H3 8 7.7 H4 21 20.2 H5 7 6.73 H6 30 28.8 H7 9 8.7 Chimpanzee   Fejerman L et al., 2004

Párové dysekvilibrium (D ) pro angiotenzinogen Párové dysekvilibrium (D ) pro angiotenzinogen. Rozsah D 0,01 to 1,00, od tvavomodré po červenou. Horizontální a vertikální osy vyjadřují fyzikální vzdálenosti mezi markery. Fejerman L et al., 2004

„Haplogroup tree“ pro gen pro angiotenzinogen „Haplogroup tree“ pro gen pro angiotenzinogen. Každý kruh reprezentuje haploskupinu. N je počet chromosomů v každé skupině a velikost kruhu reflektuje velikost N. Délka ramen je proporcionální počtu mutací(z 19 SNP vybraných pro definici haplotypových skupin), které oddělují haplotypové skupiny. Hvězdičky jsou mutace. Černé hvězdičky pro totožné nukleotidy se šimpanzy. Fejerman L et al., 2004

Haplotypy pro AGT, založené na 21 SNP a šimpanzí sekvenci Haplotypy pro AGT, založené na 21 SNP a šimpanzí sekvenci. Velikost kruhů odráží frekvence haplotypů u Kaukaziánů (A) a Japonců (B). Am J Hum Genet. 2002 January; 70(1): 108–123. Published online 2001 November 30.

Struktura genu pro AGT: a G-1074T, b C-532T, c G-217A, d A-20C, e A-6G, f C68T, g C3889T (T174M), h C4072T (T235M).

Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární M235T ATG Pg = 0,06

Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární ATG-6A/G Pg=0,001 Pg=0,07

Příklady asociačních studií: Haplotypy- -6A/G a M235T ATG OR=7,15, Pcorr=0,00001, ST =99%-98,5%. OR=5,75, Pcorr=0,01, ST =95%-83%.

Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS (ICHS) vs Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS (ICHS) vs. pacienti s CAD (3K) Haplotypy ATG (-6A/G + M235T) Vyšší frekvence výskytu GT haplotypu u pacientů s CHSS pro ICHS OR = 6,35; Pcorr. = 0,0006, PT- 95%

Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS (DKM) vs Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS (DKM) vs. pacienti s CAD (3K) Haplotypy ATG (-6A/G + M235T) Vyšší frekvence výskytu GT haplotypu u pacientů s CHSS pro DKM OR = 7,86; Pcorr = 0,0001 PT= 98%

Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS vs Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS vs. kontroly Dvojgenotyp ATG (-6A/G a M235T ATG OR=2,63 (95% konfidenční interval 1,39-4,95), P=0,002, Pcorr=0,02

Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS vs Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS vs. kontroly-ženy Dvojgenotyp ATG (-6A/G a M235T ATG) OR=15,5 (95% konfidenční interval 1,86-129,42), P=0,002, Pcorr=0,008

Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS vs Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Pacienti s CHSS vs. pacienti s CAD (3K) Haplotypy ATG (-6A/G a M235T ATG) OR=7,15, Pcorr=0,00001, PT =99%-98,5%. OR=0,17, Pcorr=0,01, PT =95%-83%.

Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Hypertonici vs Angiotensinogen a nemoci kardiovaskulární Hypertonici vs. kontroly Alela A (-6A/G), alela M (M235T) ATG OR pro obézní hypertoniky =3,05, Pcorr=0,0001 OR pro obézní hypertoniky =1,95, Pcorr=0,02

Angiotensinogen a sclerosis multiplex Pacienti se sclerosou multiplex vs. kontroly-ženy Dvojgenotyp ATG (-6A/G a M235T ATG) OR=17,65 (95% konfidenční interval 2,31-134,71; P=0.00009, Pcorr=0.0006)

Angiotensinogen a sclerosis multiplex Pacienti se sclerosou multiplex vs. kontroly-ženy Dvojgenotyp ATG (-6A/G a M235T ATG) OR=4,67 (95% konfidenční interval 1,31-16,63; P=0,008, Pcorr=0,04

Angiotensinogen a sclerosis multiplex Pacienti se sclerosou multiplex vs. kontroly-ženy Dvojgenotyp ATG (-6A/G a M235T ATG) OR=0,28 (95% konfidenční interval 0,13-0,61, P=0,0008, Pcorr=0,005

Vztah mezi zánětem a rakovinou

Patofyziologické mechanismy spojující obezitu a rakovinu střev (John BJ, 2006) Patofyziologické mechanismy spojující obezitu a rakovinu střev

Vztah mezi zánětem a rakovinou

Pacienti s kolorektální karcinomem vs Pacienti s kolorektální karcinomem vs. kontroly-muži Dvojgenotyp ATG (-6A/G a M235T ATG) OR pro MTAG=3,82 (2,09-6,96) P=0,0002, Pcorr=0,002 OR pro MTGG=0,24 (0,08-0,75) P=0,007, Pcorr=0,05

Farmakogenetika a vývoj léků Nutnost přesné diagnózy (k fenotypicky podobným stavům mohou vést různé patobiochemické mechanismy). Individuální odpověď jedince na terapii může záležet na genech, vstupujících do interakce s metabolismem léku nebo jeho působením. Polovina všech dosud používaných léků je metabolizována enzymy P450.

Farmakologická léčba-241 pacientů s chronickým srdečním selháním Inhibitory ACE A/N 241 (100%) Beta blokátory A/N 150/91 (62%) ACEI + BB A/N Diuretika A/N 214/27 (89%) Aspirin A/N 133/108(55%) Inhibitory Ca A/N 7/233 (3%) Verospiron A/N 157/84 (65%) Digoxin A/N 163/78 (68%) Inzulín A/N 20/221 (8%) Perorální antidiabetika A/N 46/195 (19%) Antikoagulační terapie A/N 52/189 (22%) Nitráty A/N 89/152 (37%) Milurit 57/184 (24%) Hypolipidemika 107/134 (44%)

Detekce genotypů inzerčně delečního polymorfismu v genu pro angiotenzin konvertující enzym (polymorfismus I/D ACE). PCR na horizontální elektroforéze ID DD II

Farmakogenetické rozdíly v dávkování beta blokátorů- genotyp I/D ACE Pg=0,005, Pa=0,002

Farmakogenetické aspekty u pacientů s CHSS –polymorfismus I/D ACE OR pro BB u II = 2,74, P=0.004 OR pro D u II = 7,76, P=0,01 OR pro Asp u II = 0,49, P=0,02

Farmakogenetické rozdíly v dávkování beta blokátorů a ACEI-polymorfismus I/D ACE OR pro II u pacientů s nižší než poloviční dávkou BB a/nebo ACEI je 2,84, P=0,002 Pg=0,006, Pa=0,009

Děkuji vám za pozornost