Bazofily a mastocyty a jejich význam v imunitních reakcích

Mastocyty (žírné buňky)‏ a)slizniční mastocyty - lokalizace: ve sliznicích dýchacího a gastrointestinálního traktu - produkují: histamin, heparin, serotonin, cytokiny, tryptázu a další enzymy, leukotrien C4 - účast: alergie a parazitózy, zvýšeny při aktivaci TH2 b) pojivové mastocyty - lokalizace: převážně v pojivu - produkují: tryptázu a chymázu a další enzymy, prostaglandin D2 - účast: při alergii a parazitozách se neúčastní, zvýšeny při fibróze

Funkce mastocytů - obrana proti parazitárním infekcím - regulace imunitní odpovědi - uplatňují se při zánětu, při angiogenezi, při remodelaci tkání - podílejí se na udržování fyziologických funkcí sliznic - přispívají k normálnímu metabolismu pojivových tkání - komunikace mezi imunitním a nervovým systémem - za patologických okolností jsou zodpovědné za časný typ přecitlivělosti

Schema aktivace mastocytu - navázání multivalentního antigenu ( mnohobuněčného parazita) pomocí IgE na vysokoafinní Fc receptor pro IgE (FcRI)‏ - agregace několika molekul FcRI iniciace degranulace mastocytu ( fúze cytoplazmatických granulí s povrchovou membránou a uvolnění jejich obsahu)‏ aktivace metabolismu kyseliny arachidonové (leukotrien C4, prostaglandin PGD2)‏ zahájení produkce cytokinů (TNF, TGF, IL-4,5,6…)

Receptory mastocytů - vysokoafinní Fc receptor pro IgE (FcRI)‏ - Fc receptor pro IgG - receptor C3aR pro komplementový fragment C3a, C4a a C5aR pro C5a (aktivace degranulace nezávislé na IgE)‏ - povrchové adhezivní molekuly (  integriny, L-selektin)‏ - receptory pro růstové faktory (IL-3, IL-4, SCF)‏

Sekreční produkty mastocytů - cytoplazmatická granula: hydrolytické enzymy proteoglykany (heparin, chondroitinsulfát)‏ biogenní aminy (histamin,serotonin) Histamin způsobuje vasodilataci, zvýšení vaskulární permeability, erytém, edém, svědění, kontrakci hladké svaloviny bronchů, zvýšení peristaltiky střev, zvýšení sekrece hlenu slizničními žlázkami v respiračním traktu a GITu. metabolity kys. arachidonové (leukotrien C4, prostaglandin PGD2)‏ Cytokiny (TNF, TGF, IL-4,5,6…)

Bazofily diferencují se z myeloidního prekurzoru bývají považovány za cirkulující formu mastocytů receptorovou výbavou, obsahem granul, mechanismy stimulace a funkcemi jsou velmi podobné mastocytům jsou zodpovědné za vznik anafylaktického šoku

Imunitní mechanismy zánětu (lokální a systémová reakce)‏

Zánět Je souhrn fyziologických reakcí na porušení integrity organismu, které vedou k ochraně proti infikování poškozeného místa, k lokalizaci poškození a jeho zhojení. První signály k rozvoji zánětlivých reakcí pocházejí od mastocytů, fagocytů a od látek uvolněných z poškozených buněk a součástí mezibuněčné hmoty. Zánět - akutní ( fyziologická obranná reakce, obvykle odezní bez následků, poškozená tkáň se zcela zhojí)‏ - chronický ( je obvykle již patologickou reakcí, dochází k částečné destrukci tkáně a nahrazení vazivem)‏ Odpověď organismu - lokální - systémová

Lokální odpověď organismu na zánět Projevy - bolest (dolor), teplo (calor), zčervenání (rubor), otok (tumor) a ztrátou funkce (funkcio laesa) zvýšení permeability cév ( vazoaktivní aminy, složky komplementu C3a, C5a, leukotrieny…; otok v místě zánětu ) zvýšení exprese adhezivních molekul na endoteliích aktivace koagulačního, fibrinolytického, komplementového a kininového systému ovlivnění místních nervových zakončení ( prostaglandiny, bolest )‏ změny regulace teploty ( IL- 1, IL-6, TNF, prostaglandiny )‏

Systémová odpověď na zánět je závislá na rozsahu poškození a délce trvání lokálního zánětu horečka (prozánětlivé cytokiny TNF, IL-1, IFN stimulují hypotalamové centrum termoregulace)‏ mobilizace tkáňového metabolismu indukce exprese Hsp (heat-shock-proteins; fungují jako chaperony)‏ produkce proteinů akutní fáze (CRP, SAP, C4, C5; opsonizace a aktivace komplementu)‏

zvýšená jaterní syntéza některých sérových transportních proteinů ( ceruloplasmin, transferin )‏ zvýšená syntéza proteázových inhibitorů ( makroglobulín )‏ leukocytóza Septický šok – při masivním průniku mikroorganismů do krevního oběhu Anafylaktický šok – při degranulaci bazofilů a aktivaci komplementu alergenem

Reparace poškozené tkáně - eliminace poškozených buněk fagocyty - aktivace fibroplastických mechanismů - aktivace angiogeneze - regenerace a remodelace tkání

Cytokiny ( tkáňové hormony )‏

Cytokiny regulační proteiny a glykoproteiny produkované leukocyty i jinými buňkami základní regulátory imunitního systému uplatňují se i mimo imunitní systém (angiogeneze, regenerace tkání, kancerogeneze, ovlivnění řady mozkových funkcí,embryoníální vývoj…)‏ cytokiny - sekretované - membránové (zajištěno lokální působení, v membráně zakotveny sekvencí asi 20 hydrofóbních AK; CD 80, CD86, CD40L, FasL..)‏

pleiotropní účinek působí v kaskádě cytokinová síť cytokinový systém je redundantní působení cytokinů - autokrinní - parakrinní - endokrinní - jsou označovány jako interleukiny (vyjímka: TNF, lymfotoxin, TGF, interferony, CSF a růstové faktory)‏

Obr. B lymfocyt komunikuje s makrofágem a T lymfocytem pomocí cytokinů

Přehled cytokinů: interleukiny ( IL-1 až IL-23 )‏ chemokiny ( IL-8 a příbuzné molekuly )‏ interferony ( IFN-, -, - )‏ transformující růstové faktory ( TGFTGF )‏ faktory stimulující kolonie ( G-CSF, M-CSF, GM-CSF )‏ faktory nekrotizující nádory ( TNF-, lymfotoxin )‏ jiné růstové faktory (SCF, EPO, FGF, NGF,LIF )‏

Rozdělení cytokinů podle funkce: Prozánětlivé cytokiny (IL-1 a , IL-6, 8, 12, 18, TNF)‏ Protizánětlivé cytokiny (IL-1Ra, IL-4, IL-10, TGF )‏ Cytokiny s aktivitou růstových faktorů hemopoetických bb. ( IL-2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 14, 15, CSF, SCF, LIF, EPO )‏ Cytokiny uplatňující se v humorální imunitě TH2 ( IL-4, 5, 9, 13 )‏ Cytokiny uplatňující se v buněčně zprostředkované imunitě TH1 ( IL- 2, 12, IFN, GM-CSF, lymfotoxin )‏ Cytokiny s antivirovým účinkem ( IFN-, IFN-IFN- )

Fyziologické imunitní regulační mechanismy

1) Regulace antigenem - vyvolání a vyhasnutí imunitní odpovědi - afinitní maturace B lymfocytů - udržení imunologické paměti - antigenní kompetice - prahová hustota komplexu MHC gpII-Ag na APC

2) Regulace antagonistickými peptidy agonista - antigenní peptid, který vyvolá plnohodnotnou odpověď T buněk (proliferace, diferenciace TH či TC a stimulace efektorových funkcí)‏ antagonista - (částečný agonista) peptid strukturně podobný antigennímu peptidu, který vyvolává kvalitativně jinou odpověď T lymfocytů (např. produkce jen některých cytokinů, nebo anergie...) - negativní signály vyvolané antagonistou mohou překonat pozitivní signály vyvolané agonistou, který je v organismu v nadbytku - některé mikroorganismy tlumí reaktivitu T lymfocytů tím, že produkují mutantní formy svých proteinů, z nichž vznikají antagonistické peptidy - možnost terapeutického využití (transplantace, autoimunita, chronické záněty)‏

3) Regulace protilátkami - protilátky kompetují s BCR o antigen (negativní regulátor stimulace B lymfocytů)‏ - imunokomplexy s IgG se váží na B lymfocyt na BCR a FcR, důsledkem je blokování aktivace B lymfocytů - imunokomplexy s C3dg mají kostimulační účinky (C3dg se váže na CR2 na povrchu B lymfocytů)‏ - zatím je nejasný význam regulace pomocí idiotypové sítě

4) Regulace cytokiny a buněčným kontaktem 4a) Interakce APC - T lymfocyt Prekurzor TH , který rozpozná infikovaný makrofág a dostane signály přes TCR, CD 28, receptor pro IL-12 a další adhezivní a signalizační molekuly proliferuje a diferencuje se na efektorové TH1 buňky, které produkují IFNa IL-2. IFNpodporuje přeměnu makrofágů v aktivované, které produkují NO (likvidace intracelulárních parazitů) a cytokiny IL-1, TNF...(stimulace lokálního zánětu). IL-2 je autokrinní růstový faktor TH1 lymfocytů. Prekurzor TH , který rozpozná infikovaný makrofág a dostane signály přes TCR, CD 28, receptor pro IL-4 a receptor pro IL-2 a další adhezivní a signalizační molekuly proliferuje a diferencuje se na efektorové TH2, které poskytují B lymfocytům pomocné signály pomocí sekretovaných cytokinů IL-4, IL-5, IL-6 a prostřednictvím adhezivních molekul CD 40L (váže se na kostimulační receptor B lymfocytů CD 40).

4b) Vzájemná regulace aktivit TH1versus TH2 O tom, zda se prekurzorové TH lymfocyty budou vyvíjet v TH1 či TH2 rozhodne poměr cytokinů IL-12 a IL-4. - IL-12 je produkován makrofágy a dendritickými buňkami stimulovanými některými mikroorganismy - IL-4 je produkován bazofily a mastocyty - cytokiny produkované TH1 (hlavně IFN) inhibují vývoj TH2 a stimulují vývoj TH1 (IL-2 stimuluje i TH2)‏ - cytokiny produkované TH2 (IL-4, IL-10) inhibují vývoj TH1 a stimulují vývoj TH2 - (vývoj TH3 je stimulován specifickým cytokinovým prostředím IL-4, IL-10, TGF; produkují TGFspolupracují s B lymfocyty v MALT)‏

4c) Cytotoxické T lymfocyty Prekurzor TC , který rozpozná komplex MHC gp I- antigenní peptid na povrchu APC přes TCR a dostane signály přes CD 28 proliferuje a diferencuje se na klon zralých efektorových cytotoxických buněk. Toto probíhá za pomoci TH1 lymfocytů produkujících IL-2. Profesionální APC jsou dendritické buňky nebo makrofágy, které jsou infikovány virem, nebo pohltili antigeny z odumřelé virem infikované, nádorové nebo stresované buňky. Aby APC mohla aktivovat prekurzor TC ,musí být sama stimulována kontaktem s TH buňkami přes CD 40, poté začne dendritická buňka exprimovat CD 80, CD86 a sekretovat cytokiny (IL-1, IL-12). Přeměna klidové APC v aktivovanou. 4d) NK buňky NK buňky jsou schopny bez předchozí stimulace, proliferace a diferenciace zabíjet nádorové či virem infikované buňky. Mají na svém povrchu stimulační(Fc receptor CD16) a inhibiční receptory (imunoglobulinové, C lektinové), výsledná reakce závisí na tom, jaké signály převáží.

4e) Mezibuněčný kontakt - inhibiční receptory, negativní regulace CTLA-4 (CD152) - ligand CD80, CD86 (aktivovanému T lymfocytu poskytuje silný inhibiční signál tlumící přílišnou reaktivitu)‏ KIR; CD94/NKG2 - inhibiční receptory NK buněk Fas - Fas L (sebedestrukční interakce na povrchu aktivovaných efektorových T lymfocytů)‏

5) Suprese zprostředkovaná T lymfocyty - vzájemná negativní interakce TH1a TH2 zprostředkovaná cytokiny (TH2 lymfocyty produkují IL-4 a IL-10, které potlačují imunitní reakce založené na TH1 buňkách)‏ - CD 8+ TS - supresorové T lymfocyty se zatím nepodařilo izolovat jako samostatnou subpopulaci ( pravděpodobně částečně identické s TC )‏ - negativně regulují aktivaci jiných T buněk (TH ,TC)‏ - likvidace APC a TH specifickými TC - vytváření cytokinového prostředí preferujícího vznik TH2 (existují subpopulace TCCD 8+,které produkují IL-4, IL-10)‏ - jako TS mohou působit anergické buňky, které kompetují s ostatními buňkami o stimulační IL-2

- rozpustné supresorové faktory - některé CD 8+ T lymfocyty produkují rozpustnou formu TCR - klonální eliminace či anergizace T lymfocytů po styku s antigenem na povrchu jiných buněk, než APC (chybí kostimulační signály), klonální eliminace je důležitá při vzniku tolerance k autoantigenům - regulační T lymfocyty (Tr1 CD 4+; podobné TH3), které produkují IL-10, pomáhají udržet toleranci k autoantigenům

6) Neuroendokrinní regulace - některé neurotransmitery působí na leukocyty (noradrenalin)‏ - přímý kontakt volných nervových zakončení s mastocyty (bolest při degranulaci mastocytů)‏ - některé endokrinní hormony působí na leukocyty (kortikosteroidy, růstový hormon, thyroxin, endorfiny...)‏ - leukocyty produkují řadu hormonů (endorfiny, ACTH, TSH, růstový hormon...)‏ - některé cytokiny působí na nervový systém (IL-1, IL-6, LIF, TNF)‏ - vliv emocionálního stresu na imunitní systém

7) Faktory ovlivňující výsledek imunitní odpovědi Tentýž antigen může navodit aktivní imunitní odpověď nebo stav aktivní tolerance, výsledek odpovědi závisí na mnoha faktorech: - stavu imunitního systému - vlastnostech antigenu - dávce antigenu - způsobu podání

HLA systém (MHC glykoproteiny)‏

MHC glykoproteiny I. třídy (major histocompatibility complex)‏ funkcí MHC gp. I. je prezentace peptidových fragmentů, které jsou produkovány buňkou, na buněčném povrchu tak, aby byly rozpoznávány T lymfocyty (cytotoxickými) přítomny na všech buňkách organismu 3 izotypy klasických lidských MHC gp. ( HLA - A, -B, -C )‏ - 3 izotypy neklasických MHC gp. ( HLA – E, -F, -G; molekuly CD1)‏

Struktura MHC gp. I - MHC gp. I. třídy se skládají z transmembránového řetězce  (45kDa) a nekovalentně asociovaného mikrotubulinu (12 kDa)‏ řetězec  má 3 domény, 2 N-terminální (– vazebné místo pro peptidya 1 C-terminální doménu (– zakotvena v cytoplazmatické membráně, struktura podobná imunoglobulinové doméně)‏ vazebné místo pro peptid je strukturně význačná rýha, jejíž dno je tvořeno  strukturou a boky jsou ohraničeny 2  šroubovicemi - vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp. a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchu

Vazba peptidů - MHC gp I. váží peptidy o délce 8 až 10 AK - určitá molekula MHC gp. váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - vazebný motiv - důležitá je povaha AK poblíž konců peptidu - k vazbě endogenních peptidů dochází v endoplazmatickém retikulu během biosyntézy MHC gp. - po vytvoření řetězce amikrotubulinu dochází v ER k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k asociaci vhodného peptidu, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu a pak je prezentován na buněčném povrchu - navázané peptidy pocházejí z proteinů degradovaných proteazómem, který štěpí cytoplasmatické proteiny určené k likvidaci (označené ubiquitinem), peptidové fragmenty jsou transportovány do ER pomocí specifických membránových pump

Neklasické MHC gp. I - HLA – E, -F, -G; molekuly CD1 - strukturně podobné klasickým MHC gp. - jsou méně polymorfní - vyskytují se jen na některých buňkách - specializují se na vazbu zvláštních ligandů

HLA - E - vyskytuje se na mnoha typech buněk - váže signální (N- terminální) peptidy pocházející z prekurzorů HLA - A, -B, -C, -G HLA - G - vyskytuje se na buňkách trofoblastu - váže mnoho různých peptidů Komplexy HLA - E a HLA - G s peptidy jsou rozpoznávány inhibičními receptory NK buněk a přispívají k toleranci plodu v děloze. Molekuly CD1 - váží glykolipidy či jiné silně hydrofobní látky (mikrobiální či organismu vlastní), tyto komplexy jsou rozpoznávány specializovanými  T lymfocyty. Ostatní - podobné MHC gp I, ale bez schopnosti vázat peptidy či jiné antigenní fragmenty - FcRn, MICA, MICB, HFE

MHC glykoproteiny II. třídy - funkcí MHC gp II je prezentace peptidových fragmentů z proteinů pohlcených buňkou tak, aby byly rozpoznatelné T lymfocyty (pomocnými)‏ - vyskytují se na APC ( dendritické buňky, monocyty, makrofágy, B lymfocyty) - 3 izotypy MHC gp II ( DR, DQ, DP )‏

Struktura MHC gp. II - MHC gp. II se skládají ze 2 nekovalentně asociovaných transmembránových podjednotek  a  (molekulová hmotnost cca 30kDa)‏ - vazebné místo pro peptid je tvořeno N-terminálními doménami 1 a 1 - vazba peptidu je nezbytná pro stabilní konformaci MHC gp. a tím zajišťuje jeho dlouhodobou prezentaci na buněčném povrchu

Vazba peptidů - MHC gp II váží peptidy o délce 15 až 35 AK (ale i delší - vazebné místo pro peptid je na obouch koncích otevřené) - určitá molekula MHC gp váže peptidy sdílející společné strukturní rysy - vazebný motiv - po vytvoření řetězce av ER dochází k poskládání do správné konformace a k vzájemné asociaci a k připojení dalšího transmembránového řetězce, tzv. invariantního řetězce, který blokuje vazebné místo pro peptid, tento komplex je dále zpracován v Golgiho aparátu; sekreční váčky oddělené od GA fúzují s endozómy, poté se rozštěpí invariantní řetězce a do vazebného místa MHC gp se naváží peptidové fragmenty endocytovaných proteinů a poté je komplex prezentován na buněčném povrchu

Genový komplex MHC (HLA)‏ - HLA komplex se nachází na chromozómu č.6 - obsahuje okolo 50 genů Obsahuje geny kódující: - MHC gp I a II - některé složky komplementu ( C2, C4, faktorB )‏ - některé cytokiny ( TNF )‏ - podjednotky proteazómu - podjednotky peptidových pump ( TAP )‏ - Hsp - jiné proteiny

Polymorfismus MHC glykoproteinů - u MHC gp. je vysoký polymorfismus, tzn. existují až stovky různých alelických forem jednotlivých izotypů (kromě neklasických MHC gp. I a kromě DR řetězce a)‏ - jednotlivé alelické formy mají zaměněnou 1 či více AK ve vazebném místě pro peptid - kodominantní dědičnost alelických forem - jedinec má na povrchu buněk 3 izotypy HLA molekul (HLA-A, -B, -C) většinou ve 2 různých alelických formách - polymorfismus má ochranný význam na úrovni jedince i na úrovni populace - polymorfismus MHC gp. způsobuje komplikace při transplantacích

HLA typizace = určení HLA antigenů na povrchu lymfocytů 1) Sérologická typizace - mikrolymfocytotoxický test - allospecifická séra ( získaná od vícenásobných rodiček do 6 týdnů po porodu, získaná vakcinací dobrovolníků, nebo komerčně připravené sety typizačních sér (monoklonální protilátky))‏ - princip - inkubace lymfocytů s typizačními séry za přítomnosti králičího komplementu, poté je přidáno vitální barvivo, které obarví mrtvé buňky - buňky nesoucí určité HLA jsou usmrceny cytotoxickými Ab proti tomuto Ag, procento mrtvých buněk je mírou toxicity séra (síly a titru antileukocytárních protilátek) - za pozitivní reakci se považuje více než 10% mrtvých bb. (sérologickou typizaci lze provádět i pomocí průtokové cytometrie)‏

2) molekulárně genetické metody - pro typizaci se používají hypervariabilní úseky ve II. exonu genů kódujících HLA II. třídy, pro určení HLA I. třídy se používá polymorfismus v II. a III. exonu kódujících genů 2a) PCR-SSP = polymerázová řetězová reakce se sekvenčními specifickými primery - extrahovaná DNA slouží jako substrát v sadě PCR reakcí - každá PCR reakce obsahuje primerový pár specifický pro určitou alelu (resp. skupinu alel)‏ - pozitivní a negativní reakce se hodnotí elektroforézou - každá kombinace alel má svůj specifický elektroforetický obraz

2b) PCR-SSO = PCR reakce se sekvenčně specifickými oligonukleotidy - namnoží se hypervariabilní úseky genů kódujících HLA - hybridizace s enzymaticky nebo radioaktivně značenými DNA sondami specifickými pro jednotlivé alely 2c) PCR- SBT = sequencing based typing; sekvenování - nejpřesnější metodika HLA typizace - získáme přesnou sekvenci nukleotidů, kterou porovnáme s databází známých sekvencí HLA alel

NASHLEDANOU