Genetická variabilita populací lipana podhorního a možné příčiny zkrácení skřelového víčka Ing. Vojtěch Kašpar, Ph.D www.frov.jcu.cz

Genetická variabilita populací lipana podhorního (Thymallus thymallus) www.frov.jcu.cz Genetická variabilita populací lipana podhorního (Thymallus thymallus)

Literární přehled www.frov.jcu.cz Pokles početnosti populací - nutnost definovat konzervační strategie a programy je hlavním důvodem fylogeografickýcha populačních studií. U lipana podhorního (Thymallus thymallus) byla genetická variabilita či struktura populací studována ještě s využitím biochemických markerů – allozymů. První práce studující genetiku lipana byly realizovány na počátku 90. let a byly omezeny na malý areál výskytu lipana – prakticky se věnovaly pouze několika říčním systémům ve Francii (Bouvet, Soewardi & Pattee 1990; Bouvet, Pattee & Maslin 1992; Persat & Eppe 1997). Pomocí těchto allozymových markerů byly sledovány rozdíly mezi populacemi pocházejícími z dvou říčních systémů ve Francii (Bouvet a kol., 1990), porovnávána genetická variabilita populací lipana a plotice (Bouvet a kol., 1992) a určována genetická struktura populací Rhony (Persat a Eppe, 1997).

Literární přehled www.frov.jcu.cz Následně publikována řada studií využívajících jaderné markery i mitochondriální DNA – mikrosatelitní markery / cytochrome B, DLOOP, případně další úseky mitochondriální DNA. Snoj a kol. (1999) vyvinuli první mikrosatelitní marker použitelný pro lipana podhorního, ale také testována crossamplifikace celé řady markerů pro jiné druhy ryb (Koskinen a Primer, 2001). Srovnání dvou geograficky odlišných populací z různých oblastí – povodí Dunaje a úmoří Jaderského moře v oblasti Slovinska (Sušnik et al., 1999).

Literární přehled www.frov.jcu.cz Studium genetických rozdílů mezi dvěma různými lokalitami (Koskinen et al., 2001). Studium vlivu vysazování lipana do volných vod (Koskinen et al., 2002), sledování genetické variability a fragmentace řek pomocí mikrosatelitních markerů (Melgaard et al., 2003). Hodnocení vlivu vysazování na genetickou strukturu lipana podhorního ve střední Evropě (Gum et al., 2006) – pomocí mikrosatelitních markerů a mitochondriální DNA byl sledován vliv vysazování ryb neověřeného původu na populace původní.

www.frov.jcu.cz Genetická diverzita lipana podhorního a stav populací v ČR (Havelka, 2009 – diplomová práce), mitochondriální DNA – cytochrome B, DLOOP. Genetická struktura populací lipana podhorního v rybářsky obhospodařovaných řekách České republiky (Hucková, 2015 – bakalářská práce) – 7 mikrosatelitních lokusů, 19 populací z ČR a 2 populace ze Slovenska. Mitochondriální DNA – cytochrome B, control region, ND1, ND-3/4 a ND-5/6, DLOOP – nejprve pomocí PCR/RFLP, následně sekvenování.

www.frov.jcu.cz BIELY POTOK SLOVIANSKA DOLINA LUČIVNA “VYSAZOVANÁ“

www.frov.jcu.cz SALZA YBBS

BIELY POTOK SLOVIANSKA DOLINA LUČIVNA SALZA YBBS “VYSAZOVANÁ“ www.frov.jcu.cz BIELY POTOK SLOVIANSKA DOLINA LUČIVNA “VYSAZOVANÁ“ SALZA YBBS

Optimalizace 10 mikrosatelitních lokusů, 8 lokusů vyhodnocováno: www.frov.jcu.cz 240 vzorků k izolaci DNA Optimalizace 10 mikrosatelitních lokusů, 8 lokusů vyhodnocováno: BFRO-004 BFRO-005 BFRO-006 BFRO-013 BFRO-015 BFRO-018 ONE-2 OGO-2

Mitochondriální DNA – DLOOP www.frov.jcu.cz Mitochondriální DNA – DLOOP Primery podle (Uiblein et al. 2001) – LRBT-25 a LRBT-1195 Primery modifikované – 2 úseky (Meraner, Gandolfi, 2012) LRBT-25-2 INT-F LRBT-1195-2 INT-R

www.frov.jcu.cz

BFRO-04 BFRO-05 BFRO-06 BFRO-13 BFRO-15 BFRO-18 ONE-2 OGO-2 Na Mean www.frov.jcu.cz BFRO-04 BFRO-05 BFRO-06 BFRO-13 BFRO-15 BFRO-18 ONE-2 OGO-2 Na Mean 5,83 11,83 3,50 9,17 9,50 15,17 SE 0,54 0,70 0,50 1,12 0,79 0,67 0,65 Ne 3,26 7,10 2,10 4,78 5,35 5,54 3,34 8,73 0,16 0,56 0,53 0,81 0,52 0,38 I 1,36 2,14 0,75 1,75 1,84 1,97 1,54 2,39 0,04 0,06 0,22 0,14 0,09 0,10 0,05 Ho 0,41 0,71 0,20 0,63 0,68 0,72 0,03 0,01 He 0,69 0,85 0,39 0,76 0,78 0,66 0,88 0,11 0,02 0,00

POTOK DOLINA LUCIVNA “VYSAZ“ SALZA YBBS Na Mean SE Ne I Ho He www.frov.jcu.cz POTOK DOLINA LUCIVNA “VYSAZ“ SALZA YBBS Na Mean 8,25 9,88 10,00 9,25 10,25 9,63 SE 1,21 1,22 1,52 1,51 1,70 1,19 Ne 5,07 5,30 4,44 5,26 4,69 0,90 0,96 0,71 0,98 0,64 I 1,73 1,72 1,64 1,77 1,74 0,20 0,22 0,25 0,19 0,13 Ho 0,58 0,56 0,60 0,57 0,61 0,59 0,09 0,06 0,07 He 0,73 0,72 0,70 0,75 0,76 0,08 0,05 0,03

www.frov.jcu.cz

www.frov.jcu.cz

Pairwise Population Fst www.frov.jcu.cz Nei distance Pairwise Population Fst POTOK DOLINA LUCIVNA “VYSAZ“ SALZA YBBS 0,000 0,086 0,092 0,009 0,098 0,022 0,023 0,090 0,099 0,101 0,113 0,068 0,091 0,105 0,020

www.frov.jcu.cz Zaznamenány výrazně vyšší počty alel na lokus oprot studii Huckové (2015), kde u 7 mikrosatelitních markerů určen průměrný počet alel A= 3,5(±2,2) a heterozygotnost He=0,41. Výsledky Grosse a kol. (2003) naopak odhalily relativně vysoké hodnoty celkové diverzity mikrosatelitův bavorských populacích lipana s průměrným počtem 12.4 alely na lokus a He = 0.48. AMOVA – většina variance uvnitř populací, na rozdíl od populací severní Evropy, kde bylo detekováno 49,1 – 58,0% variability mezi populacemi (Koskinen et al. 2002). Výsledky budou využity pro přípravu testu heritability – určení paterninty. Mitochondriální DNA – určení zastoupení haplotypů - Atlantské / Dunajské / Jaderské v generačních hejnech (vzorkování značených ryb).

Možné příčiny zkrácení skřelového víčka www.frov.jcu.cz Možné příčiny zkrácení skřelového víčka

www.frov.jcu.cz

www.frov.jcu.cz

www.frov.jcu.cz

Sledování výskytu deformit u juvenilních lososů a v průběhu 90 dnů. www.frov.jcu.cz Sledování výskytu deformit u juvenilních lososů a v průběhu 90 dnů. Zkrácené víčko se vyskytuje u diploidních i triploidních jedinců – zaznamenán výskyt až u 35% jedinců Zkrácené skřelové víčko shledáno jako reverzibilní anomálie.

www.frov.jcu.cz Sledován vliv vysokého obsahu vitaminu A a inkubační teploty na výskyt deformit Inkubační teplota shledána jako hlavní faktor ovlivňující deformity kostí a zkrácení skřelového víčka.

www.frov.jcu.cz Porovnání růstu, efektivity produkce a výskytu deformit u 2n a 3n populací lososa. 3n populace znatelně více deformit – u skřelového víčka nebyl však tento rozdíl signifikantní.

www.frov.jcu.cz Zkrácené skřelové víčko zaznamenáno i v rámci experimentu zaměřeného na sledování vlivu amoniaku na růst. Růst, welfare a průběh smoltifikace nebyly ovlivněny dlouhodobým působením amoniaku. Zkrácení skřelového víčka zaznamenáno u všech skupin, kvantitativně nehodnoceno.

www.frov.jcu.cz

Ověřován vliv teploty inkubace na výskyt různých typů deformit. www.frov.jcu.cz Ověřován vliv teploty inkubace na výskyt různých typů deformit. Prokázáno, že suboptimální teplota měla za následek deformované skřelové víčko.

Obohacování vířníků o další látky – vitamin A. www.frov.jcu.cz Obohacování vířníků o další látky – vitamin A. Studován vliv vitaminu A na formování kostry, především na splachnocraniu. Vitamin A pozitivně ovlivňoval tvorbu skřelového víčka.

11 mikrosatelitních lokusů, 8% jedinců se sledovaným znakem. www.frov.jcu.cz Založeno 83 rodin, sledován výskyt deformit skřelového víčka, určována příbuznost a dědičnost tohoto znaku. 11 mikrosatelitních lokusů, 8% jedinců se sledovaným znakem. Určena heritabilita chybějícího skřelového víčka na úrovni 0, 032.

Určena heritabilita chybějícího skřelového víčka na úrovni 0, 37. www.frov.jcu.cz Experimentální křížení, odchov potomstva a sledování deformit u více než 900 odchovávaných jedinců odchovávaných v různých podmínkách. Určena heritabilita chybějícího skřelového víčka na úrovni 0, 37.

SELEKCE VHODNÝCH RODIČŮ – GENOTYPOVÁNÍ ZNAČENÝCH RYB www.frov.jcu.cz TEST HERITABILITY: SELEKCE VHODNÝCH RODIČŮ – GENOTYPOVÁNÍ ZNAČENÝCH RYB VYTVOŘENÍ EXPERIMENTÁLNÍCH POPULACÍ – KŘÍŽENÍ RYB S PROJEVEM ZNAKU A RYB NORMÁLNÍCH ZNAČENÍ A VZORKOVÁNÍ POTOMSTVA ODCHOV POTOMSTVA VE SKUPINÁCH A NĚKOLIKA OPAKOVÁNÍCH SLEDOVÁNÍ PROJEVU ZNAKU U POTOMSTVA URČENÍ PARENTITY POMOCÍ METOD MOLEKULÁRNÍ GENETIKY

www.frov.jcu.cz

www.frov.jcu.cz

www.frov.jcu.cz