Cytogenetika Iva Jašková jasce2@seznam.cz Cytogenetika jako vědní disciplína Buněčné komponenty Genetické aspekty dělení buněk a gametogeneze  Iva Jašková jasce2@seznam.cz

Cytogenetika jako vědní disciplína - oblastmi zájmu jsou buněčné organely a struktury přímo související s přenosem a expresí genetické informace, důraz se klade na chromozómy, genetické aspekty buněčného dělení a s nimi související struktury Karyologie - nauka o struktuře a funkci buněčného jádra Cytologie - věda zabývající se anatomií a fyziologií buněk a jejich strukturních komponent

prokaryotické eukaryotické Typy buněk Buňky prokaryotické eukaryotické - bakterie, archea, sinice - rostliny, živočichové, prvoci, houby

Eukaryotické buňky a její komponenty buněčné komponenty (organely) jsou přímo nebo nepřímo spojené s genetickými procesy (např. jádro, ribozómy) nebo se podílejí na procesech syntézy či rozkladu látek - na buněčném metabolismu (např. Golgiho aparát)

golgiho aparát - systém cisteren, váčků a vakuol; funkcí GA je postsyntetická úprava proteinů endoplazmatické retikulum - místo syntézy lipidů a sacharidů, segregace proteinů z cytoplazmy a jejich posttranslační úprava; drsné ER má připojené ribozómy, hladké ER přidružené ribosomy postrádá mitochondrie - kulovité nebo vláknité organely s vlastní DNA - mimojaderná dědičnost (ačkoli je podstatná část lidského genomu uložena v jaderné DNA, 37 strukturních genů je kódováno v cirkulárním mitochondriálním genomu), hlavní funkcí mitochondrií je získání a uvolňování energie pro činnost buňky

ribozómy - komplex RNA a proteinů; nasedlé na endoplazmatické retikulum, nebo volně v cytoplazmě; skládají se ze dvou podjednotek, které opouštějí jádro jadernými póry a pronikají do cytoplazmy, spojí se s mRNA a probíhá v nich syntéza bílkovin, zpráva nesená mRNA obsahuje kód pro sekvenci aminokyselin v proteinu cytoplazma - základní matrix, v níž jsou zanořeny jednotlivé organely a depozita cukrů, tuků a pigmentů; oddělena cytoplazmatickou membránou

jádro - skládá se z jaderné membrány, chromatinu, jadérka a matrix jaderná membrána – ohraničuje jádro, tvořená dvojicí membrán oddělených úzkým prostorem (perinukleární cisterna) chromatin – složen ze svinutých řetězců DNA vázaných na bazické proteiny jadérko - kulovitá struktura bohatá na obsah RNA a proteinů jaderná matrix - amorfní substance tvořená především proteiny, metabolity a ionty

Chromozóm specifické útvary, které se diferencují v buněčném jádru v průběhu jeho dělení a které slouží pro uložení a rovnoměrné rozdělení GI při jaderném dělení nesou GI, tj. molekulu DNA chromozóm se diferencuje z tzv. vláken jaderného chromatinu – tvořena komplexem bílkovin typu histonů a DNA; nukleozómy – elipsoidní podjednotka eukariotického chromatinu, která obsahuje dřeňovou částici tvořenou oktamerem histonů a 146 páry bází DNA solenoid – vzniká spiralizací nukleozómů solenoidy uspořádány do smyček → základní segment chromozómů

Genetické aspekty dělení buněk a gametogeneze amitóza - proces nerovnoměrného rozdělení GI; přímé dělení buněk - buňka se dělí prostým protažením a zaškrcováním, u člověka výjimečně, např. u buněk nádorových mitóza - proces dělení se zachováním rodičovského počtu chromozómů; proces, který vede při dělení somatické buňky k zachování stejné GI v buňkách dceřinných meióza - (meiotické dělení, redukční dělení) - buněčné dělení, při kterém dochází k produkci buněk se zredukovaným počtem chromozómů (2n -> n), což je základní proces umožňující pohlavní rozmnožování, úkolem je zajistit redukci, rekombinaci a segregaci GI, zahrnuje dvě po sobě následující dělení - heterotypické (vlastní redukční dělení rozdílné od mitózy) a homeotypické (ekvační dělení shodné s mitózou, probíhá však pouze při haploidní chromozómové sestavě)

Buněčný cyklus generační čas buňky, zahrnuje období jejího růstu (fáze G1, S, G2) a dělení (fáze M) výsledkem období růstu je zdvojení genetického materiálu jádra, který se v následujícím procesu dělení přesně rozdělí do dceřinných buněk po mitóze buňka vstupuje opět do fáze G1, tj. do období růstu a realizace GI a dalšího opakování celého buněčného cyklu, nebo se z něj naopak stahuje (např. diferencované buňky, které se již nedělí)

Fáze mitózy profáze – spiralizace chromatinových vláken a diferenciace chromozómů, rozpuštění jaderné membrány, na chromozómech patrné podélné zdvojení na dvě chromatidy metafáze - chromozómy se seskupují v ekvatoriální rovině buňky, nejvhodnější období mitózy pro cytogenetická vyšetření anafáze - rozdělení centromér a tím oddělení chromatid, které jsou uchyceny k vláknům vycházejícím od opačného pólu dělícího vřeténka telofáze - nahloučení chromozómů u buněčných pólů, jejich postupná despiralizace, vytváření jaderných membrán, vznik dceřiných buněk

Fáze meiózy heterotypické, neboli I. redukční dělení podstatně se odlišuje od mitózy, zejména v profázi, kt. se dále rozčleňuje: leptotene, zygotene, pachytene, diplotene v průběhu pachytene dochází ke crossing-overu !!! homeotypické, neboli II. redukční dělení – prakticky schodné s mitózou, probíhá však pouze při haploidní chromozómové sestavě

Chromozomální počet somatické buňky – diploidní (dvojnásobný, 2n) počet pohlavní buňky - haploidní (poloviční, n) počet splynutím 2 pohlavních buněk vznikne zygota s diploidním počtem chromozómů!!!!!!!! v somatických buňkách je každý chromozóm obsažen 2x → chromozómy párové

Gametogeneze - proces tvorby pohlavních gamet mechanismus zvyšující genetickou variabilitu doprovázející pohlavní rozmnožování spermiogeneze (vznik spermií) a oogeneze (vznik oocytu - vajíčka) pohlavní rozmnožování - střídání diploidní a haploidní fáze obě fáze mají řadu genetických aspektů zdůvodňujících výhodnost pohlavního rozmnožování (segregace vloh, rekombinace a kombinace vloh) - to umožňuje vyšší genetickou proměnlivost nepohlavní rozmnožování je geneticky konzervativnější (nový jedinec vzniká ze somatické buňky)

rodičovský organismus pohlavní buňky oplození zygota pohlavní buňky

Chromozomy a karyotyp

Makrostavba chromozómů

Makrostavba chromozómů satelit sekundární konstrikce primární konstrikce (zde umístěna centroméra)

Tvary chromozómů - podle uložení centroméry metacentrické (raménka stejně dlouhá) submetacentrické (jedno raménko mírně kratší) akrocentrické (jedno raménko znatelně kratší) telocentrické (pouze 1 raménko)

2p23 Značení chromozómů číslo chromozómu rameno oblast na rameni číslo úseku (pruh)

Autozómy a gonozómy Chromozómy: somatické – autozómy tvoří homologní !!! páry určují všechny vlastnosti organismu mimo pohlaví pohlavní – gonozómy určují pohlaví jedince (ale nesou i jiné geny) jsou heterologní !!! (označení X a Y)

Karyotyp versus idiogram Karyotyp - skutečný, opticky zjištěný tvar a počet chromozomů u konkrétní buňky, v buněčných jádrech určitého organismu a druhu je konstantní do počtu, velikosti i tvaru chromozómů a jako takový se používá jako druhový znak. Idiogram - schématické, ideální znázornění karyotypu určitého organismu.

Jak je to u člověka ??? zdravý člověk má 23 párů chromozómů: 22 párů - autozómy 1 pár - pohlavní chromozómy určení pohlaví: mužské pohlaví primárně určeno přítomností chromozómu Y – není-li v zygotě přítomen, vyvíjí se jedinec ženského pohlaví Barrovo tělísko (sex chromatin, X chromatin) – inaktivovaný jeden z obou X u žen

Chromozómy člověka dělíme podle jejich makrostavby do několika skupin: A - 1., 2, 3 - velké metacentrické B - 4, 5 - velké submetacentrické C - 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, X – střední submetacentrické D - 13, 14, 15 - střední akrocentrické E - 16, 17, 18 - malé submetacentrické F - 19, 20 - malé metacentrické G - 21, 22, Y - malé akrocentrické

Fotka z elektronového mikroskopu – gonozómy u osla

Variabilita chromozomálního počtu, tvaru a struktury chromozomů důsledkem působení mutagenních faktorů a chyb v průběhu reprodukce buněk vznikají chromozomové aberace, které jsou příčinou vrozených poruch zdraví chromosomové aberace jsou mutace na chromosomální úrovni můžeme je rozdělit na strukturní (jako jsou různé delece či inverze chromosomů), nebo numerické

Variabilita chromozómálního počtu, tzv. genomové mutace zde řadíme buď euploidie, kdy je znásobena celá chromosomová výbava (triploidie, tetraploidie) nebo aneuploidie, kdy se početní odchylka týká pouze některého chromosomu (trisomie, monosomie)

Numerické odchylky autosomů Downův syndrom nejčastější chromozomální vada u člověka s frekvencí asi 1 na 700 živě narozených dětí trizomie 21. chromozomu → místo obvyklých 46 chromozomů (uspořádaných ve 23 párech) jich mají 47 (22 párů a jednu trojici chromozomu 21)

Edwardsův syndrom chromozomální vada s frekvencí 1:3000 novorozenců způsoben nadpočetným chromozomem 18. → místo obvyklých 46 chromozomů (uspořádaných ve 23 párech) jich jedinci s Edwardsovým syndromem mají 47 (22 párů a jednu trojici chromozomu 18)

Patauův syndrom chromozomální vada s frekvencí 1:5000 novorozenců způsobená nadpočetným chromozomem 13 → místo obvyklých 46 chromozomů (uspořádaných ve 23 párech) jich jedinci s Patauovým syndromem mají 47 (22 párů a jednu trojici chromozomu 13)

Numerické odchylky gonosomů Turnerův syndrom karyotyp 45,X - monosomie chromosomu X výskyt asi 1 / 10000 narozených dívek (velké množství případů tohoto syndromu končí spontánním potratem) přítomnost jen jednoho chromozomu X má těžký efekt na pohlavní soustavu dívky manifestace: opožděný sexuální vývoj, malá postava, většinou sterilita, absence sekundárních pohlavních znaků, syndrom není spojen s poruchou intelektu.

Klinefelterův syndrom vyskytuje se cca u 1 z 500-1,000 nově narozených dětí mužského pohlaví, pro svou častou nenápadnost může tato porucha zůstat poměrně dlouho nediagnostikována u nemocného s Klinefelterovým syndromem se v buňkách nachází 47 chromozomů, má totiž 3 pohlavní chromozomy - 2 chromozomy X a 1 chromozom Y nositelé bývají vyšší, mají dlouhé končetiny, hypogonadismus, jsou neplodní, hladiny testosteronu bývají výrazně nižší→ méně mužné rysy, méně svalové hmoty, u některých gynekomastie, ženský typ pubického ochlupení, vyšší hlas a ukládání tuku v oblasti boků, inteligence postižených bývá relativně normální, někdy se však u nich vyskytují poruchy učení

Syndrom 3X (Triple X) dříve známý jako Superfemale (doslova "superžena") výskyt asi 1 / 1000 narozených dívek manifestace: mírná mentální retardace (avšak vzácně), omezená plodnost (způsobená nadpočetným X chromosomem) většina případů není diagnostikována pro minimální fenotypový projev.

Syndrom XYY dřívé známý jako Supermale - doslova "supermuž") výskyt asi 1 / 1000 narozených chlapců manifestace: může být vyšší postava, snížená plodnost (způsobená nadbytečným Y chromosomem), vzácně mírná mentální retardace dřívější předpoklady o zvýšených sklonech k agresi nebyly potvrzeny většina případů není diagnostikována pro minimální fenotypový projev.

Strukturní aberace jsou následkem chromosomových zlomů, na které následuje určitá přestavba mohou vznikat spontánně nebo jako následek působení různých vnějších faktorů typy: heterozygotní aberace - změny uvnitř jednoho chromozómu z páru homozygotní aberace - stejné změny u obou chromozómů homologního páru, obvykle vznikají vzácně, častější je jejich vznik splynutím dvou gamet se shodnou vadou intrachromozomální aberace - přestavby uvnitř jednoho chromozomálního páru (např. delece, duplikace, inverze, kruhový chromozóm, izochromozóm) interchromozomální aberace - přestavby mezi chromozómy více homologických párů (zpravidla dvěma) - např. translokace a chromozomální fúze   

Typy strukturálních aberací abychom si vysvětlili hlavní typy strukturálních chromozómových přestaveb, vyjdeme z modelu chromozómového páru, jehož normální stav, tedy před aberací, vypadá následovně:

Typy strukturálních aberací delece - ztráta části chromozómu duplikace - zdvojení nebo zmnožení identických úseků chromozómů

inverze - převrácení úseku chromozómu o 180° paracentrická inverze 2) pericentrická inverze

kruhový chromozóm - obě koncové části chromozómu se spojí a vytvoří kruh

translokace - přemístění - vzniklý fragment chromozómu se zapojí na nové místo v genomu chromozomální fúze – zvláštní typ translokace, spojení ramen nebo celých chromozómů

Strukturní aberace Syndrom Cri du Chat = syndrom kočičího křiku způsoben delecí na p raménku (krátkém raménku) 5. chromosomu u 1 z 20,000-50,000 živě narozených dětí manifestace: pláč připomínající mňoukání kočky, malformované ušní boltce, mentální retardace, vrozené vady srdce

Zjišťování karyotypů u lidí Vyšetření karyotypu indikujeme u: těhotných žen, u kterých je zvýšené riziko vrozené vývojové vady (v případě pozitivního biochemického či ultrazvukového screeningu či pozitivní rodinné anamnézy) těhotných žen nad 35 let, u kterých je obecně zvýšené riziko chromozomálních aberací, zvláště pak Downova syndromu (u této a předcházející možnosti se samozřejmě provádí vyšetření karyotypu plodu) novorozenců a dětí, u kterých je důvodné podezření na některou chromozomální aberace dospívajících a dospělých, u kterých nacházíme poruchy puberty či pohlavního vývoje neplodných párů, u kterých byly vyloučeny jiné příčiny neplodnosti, nebo u párů s několika spontánními potraty zájemců o dárcovství vajíček či spermií

Co potřebujeme, abychom sestavili karyotyp? pro vyšetření karyotypu je nutné zachytit buňky (při vyšetření karyotypu člověka se používají kultivované, dělící se leukocyty, odebrané z periferní krve) při mitóze (nejlépe v metafázi), k čemuž se dodnes používá vřeténkový jed - kolchicin

Metody identifikace chromozómů Konvenční metody zhotoví se mikroskopický preparát → pod mikroskopem se najdou buňky s vhodnou metafází → vyfotografování → vystřižení jednotlivých chromozómů, identifikace a sestavení do párů

Proužkovací metody proužkovací metody využívají různé afinity některých barviv (např. trypsin, močovina, různé roztoky solí atd.) k různým úsekům chromozómů na zhotovené mikrofotografii můžeme doložit a odečíst šíři i počet pruhů, které jsou u homologních chromozómů naprosto totožné umožňuje přesnou identifikaci chromozómů, ale i určení chromozomálních přestaveb např. Q-pruhy

Autoradiografie na principu značení radioaktivním tricinem → zabudován do DNA na místo thyminu

FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) nejčastěji používaná cytogenetická metoda chromozomy nebo jejich úseky jsou ve zkoumaném vzorku znázorněny tak, že se na ně váže specifická sonda označená fluorescenčním barvivem a z obrázku získaného ve fluorescenčním mikroskopu je zjištěno, zda počet chromozomů je normální, případně který chromozom chybí nebo přebývá lze také zjistit, zda struktura určitého chromozomu je normální, nebo některý jeho úsek chybí nebo přebývá, což všechno by mohlo vést ke vzniku vrozené vady

Děkuji za pozornost