Mgr. Petra Straková Podzim 2014 Bakteriofág Mgr. Petra Straková Podzim 2014
Průběh cvičení Test – 18 otázek, výstižné odpovědi !! max. 30 minut Práce s bakteriofágem
Bakteriofág Virus bakterií 2 životní strategie – lytický a lyzogenní bakteriofág Virulentní a temperovaný bakteriofág Nás zajímá lytický fág!! Zajímavost: fágová terapie
Bakteriofág Životní cyklus: adsorpce penetrace replikace fágové DNA uvolnění virionů V tekutém médiu – dojde k vyčeření Na misce – tvorba plak
Bakteriofág Buňka napadená fágem -> uvnitř se nachází fágové potomstvo ->lýze a uvolnění do okolí Předpokladem: více hostitelských buněk než fágových částic
Stanovení počtu virionů
Stanovení počtu virionů 1) Lyzát fága 812 se zředí v TRIS HCl pufru (0,1 ml lyzátu + 0,9 ml TRIS)= 6 zkumavek. 2) Připravíme si dalších 6 zkumavek s 3 ml 0,7% MPA rozvařeného a vytemperovaného na 45 °C. K 20 ml hostitelských buněk (S.aureus SA 812) přidáme 2 ml 0,22% CaCl2 a nakonec přidáme 0,3 ml inokula do každé zkumavky s 3 ml 0,7% MPA. 3) Na misky s 2% MPA pipetujeme 0,1 ml fágového lyzátu a hned se přelije zkumavkou s hostitelskými buňkami -> krouživým pohybem se rozmíchá a nechá se ztuhnout. 4) Inkubace 30 °C 24 hodin - > ODEČET !
Hodnocení Hodnocení: Vybereme si vhodné ředění (20-200 plak) Průměrný počet plak * ředění (10x) * 10 Výsledek v PFU/ml