Metabolismus kosti Jana Novotná

Kostní matrix Anorganická – 65% Organická – 20% Voda – 10% Hydroxyapatit - Ca10(PO4)6(OH)2 Oktafosforečnan vápenatý - Ca8H2(PO4)6.5H2O Brusit - CaHPO4.2H2O Amorfní fosforečnan vápenatý- Ca9(PO4)6 Organická – 20% Kolagen I Kostní glykoproteiny Kostní specifické proteoglykany Růstové faktory Voda – 10%

Iontové složení kostního minerálu (mmol/g suché kostní tkáně bez tuku) Kostní buňky nediferencované mesenchymové buňky osteoblasty buňky lemující kost osteocyty osteoklasty Iontové složení kostního minerálu (mmol/g suché kostní tkáně bez tuku) Anionty množství PO3- 4.02 CO32- 0.79 Citrate3- 0.05 Cl- 0.02 Kationty množství Ca2+ 6.66 Mg2+ 0.18 Na+ 0.32 K+ 0.02

Kostní tkáň Optimální orientace kolagenních fibril tlak a tah působící na kost. Dědičné abnormality postihující kolagen – osteogenesis imperfekta: záměna některých aminokyselin v kolagenu typu I. zvýšená lomivost kostí. Minerální složka je mezi fibrilami kolagenu uložena tak, aby byla zachována mechanická stabilita kosti. Uspořádání kolagenních fibril závisí na věku jedince.

Kostní tkáň Osteocyty – 90% všech kostních buněk - nejsou synteticky aktivní, podílejí se však na obměně minerálů, účastní se remodelace při poškozeních (únavové zlomeniny) kontrola pohybu iontů dovnitř kosti a ven. Osteoblasty – produkují základní kostní hmotu vysoká proteosyntetická aktivita. Osteoklasty - buňky odbourávající kostní tkáň obsahují četné lysosomy s proteolytickými enzymy (kolagenasu, gelatinasy, katepsiny,glykosidasu, sulfatasu, anorganickou pyrofosfatasu, izoenzym kyselé fosfatasy). Membrána obsahuje protonovou pumpu – snížení pH 7 na pH 4

Kostní tkáň Schéma fyziologické jednotky kostní tkáně: A - cévní prostor B – osteocyt C – kostní kanálek D - nexus mezi sousedními buňkami E – pojivová tkáň

Porovnání koncentrací elektrolytů (mM/l) mezi systémovou ECT (plasmou) a kostní ECT Ca Mg K Na Pi Cl Plasma 1.5 0.7 4 140 1.8 100 Kostní tekutina 0.48 0.4 25 125 1.8 130 Kostní membránu, která udržuje stálost koncentrace elektrolytů v kostní ECT, tvoří buňky lemující kost.

Fáze kostní tvorby Mechanismus tvorby kosti: Tvorba kosti a mineralizace (embryonální vývoj). Růst kostí. Udržování kostní tkáně (remodelace, hojení). Mechanismus tvorby kosti: Vznik kosti z chrupavky – enchondrální osifikace. Intramembránová osifikace – ploché kosti (embryonální vývoj). Apoziční tvorba – periostální rozšiřování kosti během modelace a remodelace.

Schéma znázorňující růstovou destičku Vertikální sloupce chondrocytů v různém stádiu buněčného cyklu. Chondrocyty jsou ploché a neaktivní. Vznikají z nich dceřiné buňky proliferativní zóny. Chondrocyty začínají proliferovat. Chondrocyty dozrávají, produkují matrixové vesikuly (místo kalcifikace). Chondrocyty se začínají zvětšovat, syntetizují kolagen typu X a alkalickou fosfatasu. Matrixové vesikuly jsou místem, kde vznikají první krystalky minerálů. Apoptotické chondrocyty degenerují. Mineralizace pokračuje, do zóny pronikají kapiláry a z kostní dřeně osteoblasty. Osteoblasty syntetizují kostní organickou extracelulární matrix.

Matrixové vesikuly Matrixové vesikuly mezi dvěma fibrilami kolagenu typu II. Ke kolagenu jsou vázány proteoglykany a kyselinou hyaluronovou (HA). V membráně jsou vázány různé fosfatasy – ALP, AMPasa, Ca-ATPasa, nucleosidtrifosfatasa pyrofosfohydrolasa (NTP-Pasa), anorganická pyrofosfatasa (PPiasa). (uvolnění enzymů z vazby na membránu zastaví kalcifikaci). Uvnitř vesikulu jsou další enzymy a proteiny podporující mineralizaci. Lokalizace růstové destičky

Důležité složky matrixových vesikulů Alkalická fosfatasa Hydrolyzuje estery kyseliny fosforečné, hlavně organických fosfátů a pyrofosfátů a uvolňuje anorganický fosfát. Hydrolyzuje pyrofosfáty (P2O74− , PPi). Má vysokou afinitu ke kolagenu. Karboanhydrasa Reguluje pH uvnitř vesikulu, odstraňuje protony vznikající jako vedlejší produkt tvorby hydroxyapatitu. Anexiny Ca2+ iontové kanály v membráně matrixových vesikulů.

Kalcifikace je kontrolovaný proces regulovaný enzymy, proteiny a fosfolipidy membrány

Biologie matrixových vesikulů Fáze 1 Ca2+ jsou přitahovány dovnitř vesikulu (Ca-vázajícími fosfolipidy a Ca2+ kanály). Akumulace PO43- (aktivita alkalické fosfatasy). Precipitace fosfátů kalcia. Anderson, C.H., 1995

Biologie matrixových vesikulů Fáze 2 4. Membrána matrixových vesikulů se rozruší (hydrolytické štěpení fosfolipasou a proteinasami). 5. Tvorba a růst krystalů hydroxyapatitu je zde samovolný proces. Anderson, C.H., 1995

Matrix hypertrofické části chrupavky obsahuje typické proteoglykany chrupavky a kolagen typu II. Během nukleační fáze se matrix smršťuje a proteoglykany agregují. Ca2+ jsou z přilehlé matrix přitahovány do hypertrofické chrupavky. Chondrocyty a matrixové vesikuly produkují alkalickou fosfatasu (vznik volného fosfátu). Pokračování mineralizace.

Složky nezbytné pro kalcifikaci Ca2+ vážou: C-propeptid kolagenu typu II (silná afinita k hydroxyapatitu) v růstové destičce. Kolagen typu I v kostní tkáni. Fosfoproteiny Proces kalcifikace může probíhat pouze za přísunu kyslíku, minerálů a živin z kapilár, v rovnováze musí být – růst, hypertrofie, remodelace matrix a její kontrolovaná resorpce a kalcifikace. Kalcifikace vyžaduje: 24,25(OH)vitamin D3 a 1,25(OH) vitamin D3, růstový hormon, hormony štítné žlázy, PTH, růstové faktory, cytokiny.

Fáze enchondrální osifikace Hypertrofie chondrocytů Kalcifikace matrix chrupavky Prorůstání krevních kapilár Diferenciace osteoblastů a osteoklastů Tvorba osteoidu Kalcifikace Fáze přestavby kosti Resorpce Syntéza a sekrece organické kostní matrix Kalcifikace nově vytvořených kostních lamel

Kostní resorpce a tvorba jsou neodělitelné procesy Osteoblasty a osteoklasty tvoří strukturu – základní multicelulární jednotku (basic multicellular unit – BMU). Osteoblasty zodpovídají za kostní resorpci Protonová pumpa pH 7 pH 4 Osteoblasty zodpovídají za tvorbu organické matrix Lysosomální enzymy osteoklastů kyselá fosfatasa katepsiny glykosidasa sulfatasa kolagenáza

Resorpce a tvorba kosti v základní multicelulární jednotce (basic multicellular unit – BMU).

Spřažení Resorpce kosti činností osteoklastů a tvorba nové kostní tkáně osteoblasty je koordinovaný postupný proces U zdravých mladých jedinců je kostní resorptce a tvorba nové kostní tkáně v rovnováze, takže kostní hmota zůstává konstantní. Patologický stav vzniká tehdy, když je resorpce a tvorba kosti v nerovnováze.

Složky organické matrix nutné pro kalcifikaci osteoidu: kolagen typu I kostní sialoprotein kostní fosfoproteiny osteonektin osteopontin malé proteoglykany růstové faktory

Hormony regulující kostní metabolismus Systémové hormony metabolismu vápníku: (Normální fyziologická hodnota Ca2+ je 8.5 – 10.6 mg/100 ml) PTH – kostní resorpce (stimuluje transformaci monocytů na osteoklasty. Kalcitonin – kostní tvorba – inhibice transformace monocytů na osteoklasty. 1,25-dihydroxycholekalciferol (1,25-(OH)2 vitamin D3) – podpora kostní tvorby (aktivace osteoblastů k syntéze kolagenu, podporuje mineralizaci).

Další systémové hormony: Glukokortikoidy – inhibují kostní tvorbu (inhibice diferenciace osteoblastů). Růstový hormon – stimuluje kostní tvorbu přes lokální růstové faktory, somatomediny (IGF-1 a IGF-2). Insulin – zvyšuje syntetickou aktivitu osteoblastů. Hormony štítné žlázy – stimulují osteoklasty, aktivují kostní remodelaci. Estrogeny – inhibují kostní resorpci, inhibují aktivitu osteoklastů přes specifické lokální faktory. Katecholaminy – antagonisté kalcitoninu. Prostaglandiny – v koncentraci 10-9 – 10-7 mol/l stimulují syntézu kolagenu, v koncentraci 10-6 mol/l syntézu kolagenu inhibují.

Lokální faktory regulující kostní metabolismus Faktory stimulující diferenciaci osteoblastů: Kostní morfogenetický faktor (BMF) Destičkový růstový faktor (PDGF) Fibroblastový růstový faktor (FGF) Insulinu podobný růstový faktor 1 (IGF-1) transformující růstový faktor-b (TGF-b). Faktory ovlivňující diferenciaci osteoklastů: Kolonie stimulující faktor (CSF) – potlačuje vývoj osteoklastů. Interferony (interferon-g) – potlačuje diferenciaci osteoklastů. Interleukiny (IL-1, IL-3, IL-6, IL-11) – stimulují diferenciaci osteoklastů.

Biochemické markery kostní tvorby alkalická fosfatasa osteokalcin prokolagenní peptidy kolagenu typu I Biochemické markery kostní resorpce kalcium a hydroxyprolin pyridinolin, deoxypyridinolin

Vznik pyridinolinu a deoxypyridinolinu

Příčné vazby tvořené pyridinolinem Pyridinolin je trojvazný, váže dva telopeptidy ke trojité šroubovici

Kolageny Jana Novotná

Všeobecný úvod Hlavní strukturální složky pojivové tkáně 29 geneticky odlišných typů kolagenu Specifické mechanické vlastnosti Stabilita pojivové tkáně, orgánů, udržování jejich strukturální integrity

Gly-X-Y Molekula kolagenů má specifickou strukturu. Název kolagen se používá jako generický termín pro proteiny s molekulou o třech polypeptidových řetězcích v podobě trojité šroubovice. Všechny kolageny charakterizuje opakující se doména tripeptidu bohatého na prolin: Gly-X-Y V pozici X a Y se často vyskytují Pro a Hypro

Charakteristické vlastnosti molekul kolagenu Motiv Gly-X-Y je charakteristický pro fibrilární kolageny. Délka molekuly fibrilárních kolagenů je 300 nm, a-řetězec obsahuje 1000 aminokyselin. Ostatní kolagenní typy mají molekulu přerušenou intramolekulárními nehelikálními úseky (kolagen VI, délka 200 nm, kolagen X, délka 420 nm). C-propeptid má zásadní význam pro zahájení tvorby trojité šroubovice. N-propeptid se účastní při regulaci průměru primární fibrily.

Molekulární struktura fibrilárních kolagenů Pravotočivá trojitá šroubovice. Kolageny jsou homotrimery nebo heterotrimery. a-řetězec je levotočivá šroubovice s odstupem 18 aminokyseslin na jednu otáčku. Glyciny jsou uvnitř helixu, ostatní aminokyseliny vně. Díky glycinům je molekula kolagenu těsně sbalená kolem osy. 4-Hypro je nepostradatelný pro tvorbu intramolekulárních vodíkových vazeb a přispívá ke stabilitě trojité šroubovice.

Sled reakcí syntézy kolagenu: transkripce a-řetězců úprava primárního transkriptu mRNA syntéza a-řetězců hydroxylace prolylových zbytků (prolylhydroxyláza) hydroxylace lysylových zbytků (lysylhydroxyláza) glykosylace hydroxylysylových zbytků tvorba disulfidických vazeb na C-konci tvorba trojité šroubovice Sekrece do ECM odštěpení N- a C-terminálních prokolagenních peptidů řazení molekul do mikrofibril oxidace lysylových a hydroxylysylových zbytků tvorba příčných vazeb zrání kolagenních fibril (tvorba dalších příčných vazeb) interakce s jinými komponentami ECM

Důležité posttranslační enzymy prolyl-4-hydroxylasa lysyl-5-hydroxylasa přeměna prolinu a lysinu na příslušné hydroxylované deriváty Kofaktory reakcí O2 (popř. superoxid) a-ketoglutarát Fe2+ kyselina askorbová galaktosyltransferasa a glukosyltransferáza glykosylují některé hydroxylysylové zbytky lysyloxidáza (hydroxylysyloxidáza) oxidace lysylových a hydroxylysylový zbytků na příslušné aldehydy tvorba příčných vazeb – Schifovy báze (inhibice b-aminopropionitrilem - lathyrogeny – hrachor, Lathyrus vulgaris lathyrismus)

Kolagen – uspořádání do fibril Kolageny I, II, III, V, IX, X

Krátké nehelikální úseky na obou koncích molekuly fibrilárních kolagenů se účastní na vzniku kovalentních příčných vazeb. Přerušení helikální molekuly u nefibrilárních kolagenů dovoluje intramolekulární flexibilitu. Trojitá šroubovice u fibrilárních kolagenů je odolná proti proteolytickému štěpení (pepsin, trypsin). Odbourávání pomocí specifických kolagenas.

Dělení kolagenů Fibrilární kolageny Kolageny FACIT (fibril associated collagens) Kolageny tvořící sítě Kolageny ukotvující velké fibrily Transmembránové kolageny Kolageny bazálních membrán Ostatní kolageny s jinými funkcemi

Fibrilární kolageny 90 % všech kolagenů Typ Molekulární složení Lokalizace I [a1(I)2a2(I)] kost, kůže, šlacha, ligamenta rohovka, cévy II [a1(II)]3 chrupavka, sklivec, nukleus pulposus III [a1(III)]3 kůže, cévy, retikulární vlákna v mnoha tkáních (plíce, játra, slezina, atd.) V XI a1(V)a2(V)a3(V) a1(XI)a2(XI)a3(XI) plíce, rohovka, kost, fetální membrány, doprovází kolagen I chrupavka, sklivec Délka molekuly je 300 nm, a-řetězec obsahuje 1000 aminokyselin.

Bazální membrána IV [a1(IV)2a2(IV)]; a1 – a6 bazální membrána Mnohanásobné přerušení šroubovice nehelikálními úseky, krátká nehelikální oblast na N- konci a globulární oblast NC1 na C- konci. Polymerizuje do polygonální sítě (díky tetramerizaci N- konců pomocí disulfidických vazeb a dimerizací mezi NC1 konci).

Mikrofibrilární kolageny Váží se na velká fibrilární vlákna VI a1(VI)a2(VI)a3(VI) časté rozšíření; dermis, chrupavka, placenta, plíce, cévní stěny Ukotvující fibrily VII [a1(VII)]3 kůže, dermální-epidermální spojení; ústní mukosa, děložní čípek Kolageny vytvářející hexagonální sítě VIII [a1(VIII)2a2(VIII)] endoteliální buňky, Descendetní membrána X [a3(X)3] hypertrofická chrupavka

FACIT kolageny IX a1(IX)a2(IX)a3(IX) chrupavka, sklivec, rohovka XII Helikální struktura přerušena na několika místech, seskupují se s velkými fibrilami IX a1(IX)a2(IX)a3(IX) chrupavka, sklivec, rohovka XII [a1(XII)]3 perichondrium, ligamenta, šlacha XIV [a1(XIV)]3 dermis, šlacha cévní stěna, placenta, plíce, játra XIX [a1(XIX)]3 lidský rhabdomyosarkom XX [a1(XX)]3 rohovkový epitel, embryonální kůže, sternální chrupavka, šlacha XXI [a1(XXI)]3 cévy

(mnohačetné helikální oblasti s nehelikálními přerušeními) Transmembránové kolageny XIII [a1(XIII)]3 epidermis, vlasové folikuly, endomysium, střevo, chondrocyty, plíce, játra XVII [a1(XVII)]3 dermální-epiderální spojení Multiplexiny (mnohačetné helikální oblasti s nehelikálními přerušeními) XV [a1(XV)]3 fibroblasty, hladké svalové buňky, ledviny, pankreas XVI [a1(XVI)]3 fibroblasty, amnion, keratinocyty XVIII [a1(XVIII)]3 plíce, játra

Interakce mezi kolageny Fibrilární a nefibrilární kolageny Chrupavka Šlacha

Molekulární model kolagenní heterofibrily II:IX:XI.

Odbourávání kolagenů Intersticiální kolagenáza štěpí monomer kolagenu mezi vazbou dvou aminokyselin - glycin 975–leucin/isoleucin 976 od C-konce.

Kolageny jsou degradovány specifickými enzymy - matrixovými metaloproteinázami (MMP´s) MMP´s jsou zinek dependentní metaloendopeptidázy syntetisovány jsou v latentní formě (zymogeny) vylučovány jsou jako proenzymy a potřebují extracelulární aktivaci pro stabilizaci struktury a katalytickou funkci potřebují Ca2+ regulovány jsou tkáňovými inhibitory matrixových metaloproteinas (TIMP´s)

Klasifikace MMP´s Enzym MMP# Substrát Kolagenáza fibroblastového typu kolagen I, II, III VII, VIII, X, želatina Kolagenáza polymorfonukleárového typu Kolagenáza karcinomu prsu MMP-8 MMP-13 stejný jako u MMP-1 Kolagen II, I a III Stromelysin-1 MMP-3 kolagen IV, V, IX, X; laminin fibronektin, elastin Stromelysin-2 MMP-10 Stejný jako u MMP-3 72 kDa želatináza MMP-2 želatina; kolagen IV, V, VII, X, XI; elastin, fibronektin 92 kDa želatináza MMP-9 želatina; kolagen IV, V; elastin

Funkce kolagenů v biomechanice Udržují strukturální integritu tkání a orgánů. Tvoří definované pericelulární mikroprostředí, které je důležité pro buněčnou integritu. Zprostředkovávají buněčnou signalizaci přes specifické receptory (integriny, specializované proteoglykanové receptory). Zprostředkovávají komunikaci mezi buňkami (adheze, diferenciace, růst, buněčná reaktivita, život buněk v mnoha směrech). Zachycují řadu růstových lokálních faktorů a cytokinů (IGF-1 a IGF-2 v kosti se váží na kolagen I).