Úvod do molekulární medicíny – cvičení

Časový plán cvičení 24.9. Úvodní hodina 1.10. Návrh studie 8.10. Izolace nukleových kyselin 15.10. Explorativní fáze (vysokokapacitní analýzy) 22.10. Validační fáze (reverzní transkripce) 29.10. Validační fáze (real-time PCR) 5.11. Statistické vyhodnocení validace 12.11. Funkční in vitro analýzy 19.11. Funkční in vitro analýzy 26.11. Funkční in vitro analýzy 3.12. Konzultační hodina 10.12. Prezentace 17.12. Udělení zápočtu C7189 Úvod do molekulární medicíny – cvičení

Statistické vyhodnocení dat (tréninková a validační fáze) C7189 Úvod do molekulární medicíny – cvičení

Surová data RT qPCR analýzy

Statistická analýza dat Parametrické vs. Neparametrické testy jednovýběrové (střední hodnota) vs. dvouvýběrové (rozdíl středních hodnot) jednostranné vs. dvoustranné použití neparametrických testů je bezpečnější, ALE mají menší sílu

Neparametrické testy - pořadové 5745 1234 2156 3998 2679 2156 2156 1 2 3 4 4 4 5 4 6 7 8 9 10 4067 + + 3467 = 4 1865 3

Neparametrické testy - pořadové 1 2 4 4 4 6 7 8 9 10

Párové vs. Nepárové testy Mann–Whitney U test neparametrický, nepárový test

Párové vs. Nepárové testy u párového testu analyzujeme hodnoty párových pozorování srovnávání dvou skupin dat, které jsou na sobě závislé, tzn., že mezi objekty existuje vazba Wilcoxonův párový test neparametrický, párový test

Biostatistické parametry

Senzitivita vs. Specificita Nízká hladina biomarkeru predikuje nemocného pacienta Vysoká hladina biomarkeru predikuje zdravého člověka Naším cílem je najít v populaci co nejvíce pacientů!

ROC analýza - statistický postup pro vyhodnocení signálů správné a falešné pozitivity a správné a falešné negativity analýza ROC křivek (ROC curve analysis) popisuje vztah senzitivity a specificity laboratorního testu při různých hodnotách cut-off

Kaplan – Meierova analýza přežití

Kaplan – Meierova analýza přežití

Kaplan – Meierova analýza přežití

GraphPad Prism 6 Statistická analýza dat v programu GraphPad Prism 6 30-denní verze volně stažitelná na http://www.graphpad.com/demos/ Statistická analýza Tvorba grafů

GraphPad Prism 6 Neparametrické testy – Mann Whitneyův test Srovnání dvou nezávislých skupin (pacient vs. kontrola) Pořadový neparametrický test 1) V úvodním dialogovém okně zvolíme sloupcové rozložení (Column) a v nabídce pro vkládání dat zadáme Enter replicate values, stacked into columns a níže nastavíme Mean, SD, N (obr. 2). Potvrdíme pomocí Create. Toto nastavení definuje každý sloupec jako samostatnou skupinu a je tedy vhodné pro nepárové testy, které tolerují různý počet hodnot v rámci skupiny dat.

GraphPad Prism 6 2) Data importujeme tak, aby každá množina byla v samostatném sloupci. Platí ale, že ve sloupcích nemusí být stejný počet hodnot nebo některé pole může zůstat prázdné. 3) Pokračujeme příkazem Analyze a v okně Analyze data vybereme Column analyses a zvolíme t tests (and nonparametric tests).

GraphPad Prism 6 4) V tabulce nastavení parametrů nastavíme nepárový test (unpaired), neparametrický (nonparametric), zaškrtneme Mann-Whitney test a potvrdíme tlačítkem OK .

GraphPad Prism 6 5) Výstupem je souhrnná tabulka udávající P-hodnotu neboli hladinu významnosti testu.

GraphPad Prism 6 ROC analýza Rozřazení vzorků na základě vhodné diskriminační hodnoty zkoumané veličiny Na úvodní kartě zvolíme sloupcové uspořádání (Column), zadáme „Enter replicate values, stacked into columns“ a Mean, SD, N. Důležité je rozdělit data do sloupců podle kritéria, které je pro ověření naší hypotézy klíčové. Př. hledání závislosti míry exprese miRNA na prognóze zvoleného nádorového onemocnění. Ukazatelem prognózy může být výskyt relapsu primárního karcinomu, proto i do datové tabulky musíme primární data rozdělit do sloupců „s relapsem“ a „bez relapsu“ .

GraphPad Prism 6 Přes příkazy Analyze > Column analyses > ROC Curve se dostaneme do konfiguračního okna, kde ponecháme předprogramované nastavení a potvrdíme OK. Výstupem je souhrnná tabulka udávající AUC a P-hodnotu, tabulka shrnující všechny testované intervaly s mírou senzitivity a specificity a ROC křivka představující vztah mezi specificitou a senzitivitou

GraphPad Prism 6

GraphPad Prism 6 Kaplan-Meierova analýza Pravděpodobnosti přežití pacientů prostřednictvím dob přežití Na úvodním okně zvolíme rozložení Survival, zadáme Start with an empty table a potvrdíme Create.

GraphPad Prism 6 Do sloupce určeného pro souřadnice osy X zadáváme čas přežití (v měsících, popř. jiné časové jednotce). Do dalších sloupců, určených pro osu Y zadáváme cenzorovaná data (OS censored), přitom ale dodržujeme rozdělení dat podle naší proměnné (např. snížená vs. zvýšená exprese).

GraphPad Prism 6 Pokračujeme přes Analyze > Survival analyses > Survival curve. V dalším dialogovém okně můžeme přiřadit význam k jednotlivým značkám pro cenzorovaná data (0, 1). Po potvrzení získáme tabulku s vyhodnocením hladiny významnosti testu a graf s křivkami přežití.