Citrátový cyklus a Dýchací řetězec Prezentace Citrátový cyklus a dýchací řetězec se zabývá lokalizací citrátového cyklu a dýchacího řetězce v buňce, enzymovými komplexy zúčastňujících se dýchacího řetězce a ději, ke kterým během citrátového cyklu a dýchacího řetězce dochází. Této prezentaci předchází prezentace Trávení a metabolismus V prezentaci jsou používány následující zkratky: NADH = nikotinamidadenindinukleotid; FADH2 = flavinadenindinukleotid; FMN = flavinmononukleotid; CoQ = ubichinon (koenzym Q); CoQH• = ubisemichinon (1e-,1H+); CoQH2 = ubichinol (2e-,2H+); ATP = adenosintrifosfát; ADP = adenosindifosfát; GTP = guanosintrifosfát; cyt = cytochrom.

Obsah 1 Citrátový cyklus Citrátový cyklus (reakce) Citrátový cyklus (schéma) Respirace (dýchání) Vnější a vnitřní respirace Dýchací řetězec Kliknutím na zvolený nadpis přejdete na příslušný snímek. Na obsah se vždy vrátíte kliknutím na animační tlačítko „Obsah“. Mitochondrie Schéma energetického metabolismu v mitochondriích Enzymové komplexy Použitá literatura

Cyklus zahajuje oxalacetát, který se v posledním stupni regeneruje. Citrátový cyklus Citrátový cyklus neboli cyklus kyseliny citronové je označení pro sled reakcí, při nichž se acetylkoenzym A mění na oxid uhličitý za současného uvolnění energie. Cyklus zahajuje oxalacetát, který se v posledním stupni regeneruje. Oxalacetát Acetylkoenzym A Citrátový cyklus je spřažen s dýchacím řetězcem a probíhá pouze ve spojení s tímto řetězcem. Obsah

Odbouráním 1 acetylového zbytku (do citrátového cyklu přichází vázaný na koenzym A) se přímo získá 1 molekula GTP (GTP se dále přeměňuje na ATP), 3 molekuly NADH a 1 molekula FADH2, dále vznikají 2 molekuly oxidu uhličitého a spotřebuje se 1 molekula vody. Obsah

Citrátový cyklus – spustit animaci Acetylkoenzym A Citrát S-CoA S-CoA Oxalacetát Isocitrát H H 2-oxoglutarát Dýchací řetězec H H Malát H H Černé kuličky znázorňují počet atomů uhlíku v molekule, červené kuličky znázorňují atomy kyslíku a bílé kuličky atomy vodíku. Animace se spustí po kliknutí na animační tlačítko „Citrátový cyklus – spustit animaci“. GTP Fumarát Sukcinylkoenzym A H H Obsah Sukcinát

Kyslík je přenášen oběhovým systémem ke každé buňce organismu. Respirace (dýchání) Během dýchání dochází k oxidaci živin, a tím vzniká energie potřebná pro pohon řady biochemických procesů. Při dýchání dochází k absorpci kyslíku z atmosférického vzduchu a naopak k výdeji oxidu uhličitého. O2 Kyslík je přenášen oběhovým systémem ke každé buňce organismu. CO2 Obsah Obr. 1. Vnější respirace

Vnější a vnitřní respirace Dýchání (respiraci) můžeme rozdělit na dvě rozdílné části jednoho procesu: Vnitřní respirace Vnější respirace Probíhá v buňkách. Složky potravy jsou odbourávány řadou chemických reakcí, z nichž většina potřebuje kyslík. Tyto reakce uvolňují energii. Dodává kyslík buňkám, a tím umožňuje vnitřní respiraci. Obsah

Mitochondrie Dýchací řetězec je lokalizován ve vnitřní mitochondriální membráně. Citrátový cyklus probíhá v matrix mitochondrie. Matrix Vnitřní membrána Mezimembránový prostor Vnější membrána Obr. 2. Mitochondrie Obsah

4H+(z matrix) + 4e- + O2 → 2H2O + energie Dýchací řetězec Dýchací řetězec je souborem reakcí, které ukončují energetické odbourávání monosacharidů, mastných kyselin, glycerolu a aminokyselin. V dýchacím řetězci probíhá oxidace redukovaných koenzymů: NADH + H+ → NAD+ + 2H+ + 2e- FADH2 → FAD + 2H+ + 2e- Protony z redukovaných koenzymů jsou přenášeny do mezimembránového prostoru. Elektrony z redukovaných koenzymů jsou přenášeny po sérii akceptorů uspořádaných v dýchacím řetězci na elementární kyslík za vzniku vody. 4H+(z matrix) + 4e- + O2 → 2H2O + energie Obsah

Dýchací řetězec Dýchací řetězec se skládá ze 4 enzymových komplexů a z enzymu ATP-synthasy. Během přenosu elektronů vzniká energie, kterou využívá každý enzymový komplex k čerpání protonů z matrix do mezimembránového prostoru Při přechodu protonů zpět do matrix vzniká energie, která pohání syntézu ATP z ADP a anorganického fosfátu. Protony roztáčí stopku hlavy ATP-synthasy, a tím dochází k syntéze ATP. Obsah

Obr. 3. Schéma energetického metabolismu v mitochondriích Vnější mitochondriální membrána Vnitřní mitochondriální membrána H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ H+ ATP - synthasa H+ H+ e- H+ H+ ATP Dýchací řetězec 3NAD+, FAD ADP + P 3NADH; FADH2 H+ 2H2O Citrátový cyklus O2 O2 Pyruvát (pyruvát je konečným produktem glykolýzy) a mastné kyseliny (ve formě acylkarnitinu) vstupují přes mitochondriální membrány do matrix mitochondrie. V matrix dochází k odbourání na acetylkoenzym A, který vstupuje do citrátového cyklu, kde se váže na kyselinu oxaloctovou za vzniku kyseliny citronové. V citrátovem cyklu dochází ke vzniku 2 molekul oxidu uhličitého, 3 molekul NADH, 1 molekuly FADH2 a 1 molekuly GTP (GTP se přeměňuje na ATP). NADH a FADH2 vstupují dále do dýchacího řetězce, kde se oxidují na NAD+ a FAD. Transport elektronů umožňuje vytvářet elektrochemický protonový gradient – protony jsou přenášeny do mezimembránového prostoru, což způsobí, že koncentrace protonů je v mezimembránovém prostoru vyšší než v matrix (pH v mezimembránovém prostoru je vyšší než pH matrix). Během přenosu protonů zpět do matrix dochází k uvolnění energie, která je využita pro tvorbu ATP z ADP a anorganického fosfátu. Elektrony jsou nakonec přeneseny na kyslík za vzniku vody. Jedná se o kyslík, který dýcháme. 2CO2 2CO2 Matrix Acetyl-CoA Pyruvát Mastné kyseliny (Pomocí přenašeče) Obsah Cytosol Pyruvát Mastné kyseliny

Enzymové komplexy (zjednodušené schema) I NADH-CoQ oxidoreduktasa II Sukcinát-CoQ oxidoreduktasa III CoQH2– cytochrom c oxidoreduktasa IV Cytochrom c oxidasa V ATP-synthasa 2H+ H+ 4H+ 4H+ Cyt c Cyt c + + + + I 2e- III IV V Koenzym Q 2e- 4e- 2H+ II 2e- - - - - Tento snímek je možné při výuce středoškolské biochemie vynechat či zařadit do semináře. Dýchací řetězec se skládá ze 4 enzymových komplexů a z enzymu ATP-synthasy. Ubichinony (koenzym Q, CoQ) a cytochromy (cyt) slouží jako pohyblivé přenašeče elektronů (koenzym Q i protonů). Během přenosu elektronů vzniká energie, kterou využívá každý enzymový komplex k čerpání protonů (protony pocházejí z vody H2O ↔ H+ + OH-) z matrix do mezimembránového prostoru – vytváří se elektrochemický protonový gradient (koncentrace protonů je v mezimembránovém prostoru daleko vyšší než v matrix). Při přechodu protonů zpět do matrix vzniká energie, která pohání syntézu ATP z ADP a anorganického fosfátu (jedná se o oxidační fosforylaci). Protony roztáčí stopku hlavy ATP-synthasy, a tím dochází k syntéze ATP. Takto popsaný vznik molekuly ATP popisuje tzv. chemiosmotická teorie, za kterou dostal v roce 1978 Peter Mitchell Nobelovu cenu. Viz též snímek č. 20. O2 + 2H+ 2e- 4H+ 2H+ 4H+ 2H2O NAD+ NADH + H+ FADH2 ADP + P FAD Matrix H+ ATP Obsah

Dýchací řetězec* (pro zájemce) Obsah: Enzymový komplex I Enzymový komplex II Enzymový komplex III Enzymový komplex IV Enzymové komplexy Snímky č. 14-23 jsou určeny pro všechny, kteří se zajímají o detailnější průběh dýchacího řetězce. Látka je nad rámec středoškolského pojetí biochemického učiva, avšak vzhledem ke složitosti probírané látky, což vede často k nepřesnostem při výkladu, je zde zařazena. Reakce enzymových komplexů Koenzymy NADH, FADH2 Koenzym Q, Koenzym QH2 Použitá literatura

Enzymové komplexy: Komplex I Komplex I: NADH-CoQ-oxidoreduktasa NADH + H+ + CoQ → NAD+ + CoQH2 2H+ 4H+ + + + + I 2Fe2+ 2Fe3+ 2CoQH2 (2e-,2H+) 2Fe3+ 2Fe2+ 2e- 2e- 2CoQH. (1e-,1H+) FMNH2 (2H+,2e-) - - - - FMN Komplex I je NADH-CoQ-oxidoreduktasa, která katalyzuje reakci: NADH + H+ + CoQ → NAD+ + CoQH2. V komplexu I dochází k přenosu dvou protonů a dvou elektronů z koenzymu NADH + H+ na prostetickou skupinu FMN (flavinmononukleotid) za vzniku FMNH2. Protony jsou dále uvolňovány do mezimembránového prostoru a elektrony (po jednom) přecházejí na další prostetickou skupinu typu FeS (kde dochází ke změně oxidačního čísla mezi Fe2+ a Fe3+). Elektrony (opět po jednom) jsou poté společně s dalšími protony z matrix přebírány semichinoidní formou ubichinonu CoQH• (ubisemichinon, mající k dispozici 1 e- a 1 H+) za vzniku ubichinolu CoQH2 (mající již 2 e-, 2 H+) – viz dále komplex III. Matrix 2H+ 2H+ NAD+ NADH + H+ Obsah

Enzymové komplexy: Komplex II Komplex II: Sukcinát-CoQ-oxidoreduktasa FADH2 + CoQ → FAD + CoQH2 4H+ + + + + II 2CoQH2 (2e-,2H+) 2CoQH. (1e-,1H+) 2e- - - - - FAD FADH2 (2H+,2e-) Komplex II je Sukcinát-CoQ-oxidoreduktasa, která katalyzuje reakci: FADH2 + CoQ → FAD + CoQH2. Komplex II je flavoprotein (obsahuje prostetickou skupinu FAD a dvě skupiny typu Fe2S2). V komplexu II dochází k přenosu dvou protonů a dvou elektronů ze sukcinátu na prostetickou skupinu FAD za vzniku FADH2 a fumarátu. Protony nejsou ihned uvolňovány do mezimembránového prostoru, jak tomu bylo v komplexu I, ale společně s elektrony přecházejí na semichinoidní formu ubichinonu CoQH• (mající 1 e- a 1 H+) za vzniku ubichinolu CoQH2 (mající již 2 e-, 2 H+) – viz dále komplex III. Matrix 2H+ Sukcinát -OOC-CH2-CH2-COO- Fumarát -OOC-CH=CH-COO- Obsah

Enzymové komplexy: Komplex III Komplex III: CoQH2–cytochrom-c-oxidoreduktasa CoQH2 + cyt c (Fe3+) → CoQ + cyt c (Fe2+) + 2H+ 2H+ Cyt c Cyt c Cyt c + + + + III IV Cyt b e- Elektron z komplexu I nebo II CoQH. (1e-,1H+) e- e- CoQH2 (2e-,2H+) e- - - - - H+ Komplex III je CoQH2–cytochrom-c-oxidoreduktasa, která katalyzuje reakci: CoQH2 + cyt c (Fe3+) → CoQ + cyt c (Fe2+) + 2 H+. Komplex III reoxiduje ubichinol (CoQH2) – produkt komplexu I a II. Ubichinol je oxidován na semichinon (CoQH•) tak, že jeden elektron přechází na cyt b a uvolní se jeden proton do mezimembránového prostoru, druhý elektron se přenese na cyt c (Fe3+ se redukuje na Fe2+) a opět se uvolní jeden proton do mezimembránového prostoru za vzniku ubichinonu (CoQ, k dispozici 0 e- a 0 H+). Na ubichinon (CoQ) se zpátky přenese elektron z cyt b a zároveň se naváže jeden proton z matrix mitochondrie za vzniku ubisemichinonu (CoQH•, mající k dispozici opět 1 e- a 1 H+). Ubisemichinon opět váže elektron z komplexu I (resp. II) a proton za vzniku ubichinolu a celý cyklus se opakuje. Jeden elektron se vždy cyklicky vrací přes cyt b, což má za následek přenos celkem dvou protonů z matrix do mezimembránového prostoru při přenosu jednoho elekronu na cyt c. (detailněji – viz následující snímky, snímky č. 17 a 18). Matrix H+ Koenzym Q Obsah

Enzymové komplexy: Komplex III Komplex III: CoQH2–cytochrom-c-oxidoreduktasa CoQH2 + cyt c (Fe3+) → CoQ + cyt c (Fe2+) + 2H+ + + + + Cyt b Cyt c Elektron z komplexu I nebo II e- H+ CoQH. (1e-,1H+) CoQH2 (2e-,2H+) CoQ e- e- H+ e- H+ CoQH. (1e-,1H+) e- H+ e- e- H+ CoQH. (1e-,1H+) H+ CoQH. (1e-,1H+) e- Na tomto snímku je schematicky pomocí animace (pohyblivých kuliček znázorňujících protony a elektrony) znázorněn přenos elektronů a protonů pomocí koenzymu Q. Animace se spustí po kliknutí na animační tlačítko „Spustit animaci“. - - - - Matrix H+ H+ H+ H+ Koenzym Q H+ H+ H+ H+ Spustit animaci Obsah

Enzymové komplexy: Komplex III Komplex III: CoQH2–cytochrom-c-oxidoreduktasa CoQH2 + cyt c (Fe3+) → CoQ + cyt c (Fe2+) + 2H+ H+ H+ + + + + e- Cyt c H+ e- Elektron z komplexu I nebo II e- CoQH2 (2e-,2H+) CoQH. (1e-,1H+) H+ H+ e- e- e- Cyt b CoQ H+ CoQH. (1e-,1H+) e- Na tomto snímku je schematicky pomocí šipek znázorněn přenos elektronů a protonů pomocí koenzymu Q. Obrázek znázorňuje průběh animace, která je k dispozici na předchozím snímku. - - - - H+ Matrix H+ Koenzym Q Obsah

Enzymové komplexy: Komplex IV Komplex IV: Cytochrom-c-oxidasa 4cyt c (Fe2+) + 02 +4H+ → 4cyt c (Fe3+) + 2H2O Cyt c Cyt c Cyt c + + + + III IV e- e- e- e- 4e- Cyt a - - - - Komplex IV je cytochrom-c-oxidasa, která katalyzuje reakci: 4 cyt c (Fe2+) + 02 + 4 H+ → 4 cyt c (Fe3+) + 2 H2O. Elektrony z cytochromu c přebírá cytochrom a; odtud jsou přenášeny na cytochrom a3 (dochází ke změně oxidačního čísla mezi Cu2+ a Cu+). Cytochrom a3 postupně redukuje molekuly kyslíku na oxidové ionty (O2-), které s protony z matrix reagují za vzniku molekuly vody. Hlavní úloha kyslíku, jejž vdechujeme, spočívá tedy v tom, aby udržoval komplex cytochromů v oxidovaném stavu. Cyt a3 O2 + Matrix 4H+ 2 H2O Obsah

Enzymové komplexy Matrix Obsah II Sukcinát-CoQ oxidoreduktasa III CoQH2– cytochrom c oxidoreduktasa I NADH-CoQ oxidoreduktasa IV Cytochrom c oxidasa V ATP-synthasa 4H+ 4H+ 2H+ H+ Cyt c Cyt c Cyt c + + + + II III I IV V CoQH. 2e- e- 2e- CoQH. e- 4e- CoQH2 CoQH2 e- e- e- 2H+ - - - - 2H+ e- O2 + 2H+ 2H+ Dýchací řetězec se skládá ze 4 enzymových komplexů a z enzymu ATP-synthasy. Ubichinony (koenzym Q, CoQ) a cytochromy (cyt) slouží jako pohyblivé přenašeče elektronů (koenzym Q i protonů). Během přenosu elektronů vzniká energie, kterou využívá každý enzymový komplex k čerpání protonů (protony pocházejí z vody H2O ↔ H+ + OH-) z matrix do mezimembránového prostoru – vytváří se elektrochemický protonový gradient (koncentrace protonů je v mezimembránovém prostoru daleko vyšší než v matrix). Při přechodu protonů zpět do matrix vzniká energie, která pohání syntézu ATP z ADP a anorganického fosfátu (jedná se o oxidační fosforylaci). Protony roztáčí stopku hlavy ATP-synthasy, a tím dochází k syntéze ATP. Takto popsaný vznik molekuly ATP popisuje tzv. chemiosmotická teorie, za kterou dostal v roce 1978 Peter Mitchell Nobelovu cenu. Dehydrogenací jedné molekuly NADH se celkem přenese 6 protonů do mezimembránového prostoru, dehydrogenací sukcinátu se přenesou jen 4 protony. Mitchell předpokládal, že na vznik jedné molekuly ATP je zapotřebí zpětného přenosu dvou protonů. To odpovídá představě, že oxidací jedné molekuly NADH vznikají 3 molekuly ATP, oxidací jedné molekuly FADH2 vznikají 2 molekuly ATP. Z toho vyplývá, že při odbourávání jedné molekuly acetylkoenzymu A vznikne 12 molekul ATP (1 z GTP, 9 ze tří molekul NADH a 2 z jedné molekuly FADH2). Nejvíce energie tedy vzniká při tvorbě vody v dýchacím řetězci. 2H+ Matrix 4H+ FADH2 FAD NADH + H+ 2H2O NAD+ ADP + P H+ Fumarát -OOC-CH=CH-COO- ATP Sukcinát -OOC-CH2-CH2-COO- Obsah

Reakce enzymových komplexů Komplex I: NADH-CoQ-oxidoreduktasa NADH + H+ + CoQ → NAD+ + CoQH2 Komplex II: Sukcinát-CoQ-oxidoreduktasa FADH2 + CoQ → FAD + CoQH2 Komplex III: CoQH2–cytochrom-c-oxidoreduktasa CoQH2 + cyt c (Fe3+) → CoQ + cyt c (Fe2+) + 2H+ Komplex IV: Cytochrom-c-oxidasa 4cyt c (Fe2+) + 02 +4H+ → 4cyt c (Fe3+) + 2H2O Kyslík udržuje komplex cytochromů v oxidovaném stavu (Fe2+ zoxiduje zpátky na Fe3+). Obsah

Koenzymy NADH, FADH2 V dýchacím řetězci probíhá oxidace redukovaných koenzymů. nikotinamidadenindinukleotid NADH + H+ → NAD+ + 2H+ + 2e- Obsah probírané látky na snímcích č. 14-23 je nad rámec středoškolského pojetí biochemického učiva. Snímky jsou určeny především pro středoškolské učitele biochemie. flavinadenindinukleotid Obsah FADH2 → FAD + 2H+ + 2e-

NADH + H+ + CoQ → NAD+ + CoQH2 Koenzym Q, Koenzym QH2 Obsah probírané látky na snímcích č. 14-23 je nad rámec středoškolského pojetí biochemického učiva. Snímky jsou určeny především pro středoškolské učitele biochemie. NADH + H+ + CoQ → NAD+ + CoQH2 FADH2 + CoQ → FAD + CoQH2 Obsah

Použitá literatura Obsah [1] ALBERTS, B. a kol. Základy buněčné biologie. Ústí nad Labem: Espero Publishing, 1997. [2] SOFROVÁ, D. – TICHÁ, M. a kol. Biochemie – základní kurz. Praha: skripta UK, 1993. [3] KARLSON, P. Základy biochemie. Praha: Academia, 1981. [4] BLOOMFIELD, M., M. Chemistry and the Living Organism. Canada: John Wiley & Sons, Inc., 1992. [5] KLOUDA, P. Základy biochemie. Ostrava: nakladatelství Pavel Klouda, 2000. [6] VODRÁŽKA, Z. Biochemie. Praha: Scientia, 1998. [7] McKEE, T. – McKEE, J. Biochemistry: an introduction. United States of America: McGraw-Hill Companies, 1999. Ilustrace Markéta Roštejnská: obr. 1 Obsah