REGULACE TRANSKRIPCE VAZBA DNA-PROTEIN STRUKTURA CHROMATINU

REGULACE TRANSKRIPCE    1. Správná lokalizace transkripčních faktorů (TF) v jádře, stabilita molekul TF - regulace: exprese TF, jejich kovalentní modifikace, např. fosforylace)  2. Vazba (TF) na DNA - regulace: kovalentní modifikace, např. fosforylace, acetylace, přítomnost dimerizujícího TF v případě heterodimerů, ...  3. Vazba koaktivátorů na TF - regulace: kovalentní modifikace, např. fosforylace, ....  4. Struktura chromatinu v oblasti promoteru: - regulace: a) „remodelace“ nukleosomu (nukleosomy remodelující multiproteinové komplexy) b) kovalentní modifikace histonů (acetylace, methylace, fosforylace) acetylace histonů: histon acetyltransferasy (HAT) x histon deacetylasy (HDAC)    5. Represe transkripce - „pasívní“ represe - „aktivní“ represe (transkripčně-represivní domény) - methylace DNA v oblasti promoteru

Jednoduché schéma transkripce a úprav primárního transkriptu

Ukázka N-blotu (GAPDH)

Iniciační komplex při transkripci

Příklady vazebných motivů pro transkripční faktory v DNA:   Sp1: GGGCGG CREB: TGACGTCA bHLH TFs: CANNTG (E-box) E2F: TTCGCGC

Transkripční faktory DNA-vazebné domény: Dimerizační domény:    DNA-vazebné domény:   1. basicka doména 2. „zinc-finger“ 3. „helix-turn-helix“ Dimerizační domény: 1. HLH („helix-loop-helix“) 2. LZ („leucine zipper“) V transkripčních faktorech jsou v kombinaci, např. basic-HLH nebo basic-HLH-LZ (bHLH-LZ)   Transkripčně-aktivační domény: 1. z kyselých aminokys. zbytků („acidic domains“) 2. bohaté na glutamin 3. bohaté na prolin

Binding of transcription factor (HLH) to DNA

2. TF s zinc-finger doménou 1. TF s basickou doménou 1.1 Leucine zipper (bZIP) c-Jun c-Fos CREB 1.2 Helix-loop-helix (bHLH) E12 E47 MyoD, Myogenin, Myf-5 ASH NeuroD  1.3 Helix-loop-helix / leucine zipper (bHLH/ZIP) USF TFEB, TFEC, TFE3 c-Myc (L-myc, N-myc, B-myc) Max, Mad, Mxi1 E2F (1-5) 2. TF s zinc-finger doménou Receptory pro steroidní hormony (kortikoidy, progesteron, estrogen, androgeny) Receptory pro thyroidní hormony Receptory pro retinoidy  3. TF s Helix-turn-helix doménou Homeo doména (Hox proteiny) POU doména (homeo + POU-specifická doména) Paired domain = párová doména (samotná nebo v kombinaci s homeo) 4. TF vážící se v obl. minor groove   (HMG skupina, TBP)

1.3 Class: Helix-loop-helix / leucine zipper factors (bHLH-ZIP). 1.3.1 Family: Ubiquitous bHLH-ZIP factors 1.3.1.1 Subfamily: TFE3 1.3.1.1.1 TFE3 1.3.1.1.1.1 TFE3-L (mouse); TFE3-L (human). 1.3.1.1.1.2 TFE3-S (mouse). 1.3.1.1.2 TFEB (human). 1.3.1.1.3 TFEC (rat). 1.3.1.1.4 Mi (human); Mi (mouse). 1.3.1.1.4.1 Mi (419 AA) 1.3.1.1.4.2 Mi (413 AA) 1.3.1.2 Subfamily: USF 1.3.1.2.1 SpF1 (sea urchin). 1.3.1.2.2 USF (human); USF (rat); USF (mouse); USF (Kenyan clawed frog). 1.3.1.2.3 USF2 1.3.1.2.3.1 USF2a (human); USF2a (mouse); USF2a (rat). 1.3.1.2.3.2 USF2b (human). 1.3.1.2.3.3 1.3.1.3 Subfamily: SREBP 1.3.1.3.1 SREBP-1 (rat). 1.3.1.3.1.1 SREBP-1a (human); SREBP-1a (hamster). 1.3.1.3.1.2 SREBP-1b (human). 1.3.1.3.1.3 SREBP-1c (human). 1.3.1.3.2 SREBP-2 (human); SREBP-2 (hamster). 1.3.1.4 Subfamily: AP-4 1.3.1.4.1 AP-4 (human). 1.3.2 Family: Cell-cycle controlling factors 1.3.2.1 Subfamily: Myc 1.3.2.1.1 c-Myc (human); c-Myc (chick); c-Myc (rat); c-Myc (mouse). 1.3.2.1.1.1 c-Myc 2 (c, h, m) 1.3.2.1.1.2 c-Myc 1 (c, h, m) 1.3.2.1.1.3 p64c-Myc (X) 1.3.2.1.2 N-Myc (mouse); N-Myc (human); N-Myc (canary); N-Myc (chick); N-Myc (clawed frog). 1.3.2.1.3 L-Myc 1.3.2.1.3.1 L-Myc (human); L-Myc (mouse); L-Myc (clawed frog). 1.3.2.1.3.2 L-Myc (206 AA) (human). 1.3.2.1.4 L-Myc2 (X) (clawed frog). 1.3.2.1.5 B-Myc (rat). 1.3.2.1.6 v-Myc (MC29). 1.3.2.2 Subfamily: Mad/Max 1.3.2.2.1 Max (mouse); Max ().  

USF1 (human) aa: 15 - 59 transcription activation domain 199 - 212 basic region 213 - 256 helix-loop-helix domain 271 – 292 leucine zipper C0012 bHLH-ZIP; 1.3.1.2.2. MKGQQKTAETEEGTVQIQEGAVATGEDPTSVAIASIQSAATFPDPNVKYVFRTENGGQVM YRVIQVSEGQLDGQTEGTGAISGYPATQSMTQAVIQGAFTSDDAVDTEGTAAETHYTYFP STAVGDGAGGTTSGSTAAVVTTQGSEALLGQATPPGTGQFFVMMSPQEVLQGGSQRSIAP RTHPYSPKSEAPRTTRDEKRRAQHNEVERRRRDKINNWIVQLSKIIPDCSMESTKSGQSK GGILSKACDYIQELRQSNHRLSEELQGLDQLQLDNDVLRQQVEDLKNKNLLLRAQLRHHG LEVVIKNDSN

Metoda „GEL-SHIFT“ (EMSA)

DNAse I „footprinting“

REGULACE TRANSKRIPCE    1. Správná lokalizace transkripčních faktorů (TF) v jádře, stabilita molekul TF - regulace: exprese TF, jejich kovalentní modifikace, např. fosforylace)  2. Vazba (TF) na DNA - regulace: kovalentní modifikace, např. fosforylace, acetylace, přítomnost dimerizujícího TF v případě heterodimerů, ...  3. Vazba koaktivátorů na TF - regulace: kovalentní modifikace, např. fosforylace, ....  4. Struktura chromatinu v oblasti promoteru: - regulace: a) „remodelace“ nukleosomu (nukleosomy remodelující multiproteinové komplexy) b) kovalentní modifikace histonů (acetylace, methylace, fosforylace) acetylace histonů: histon acetyltransferasy (HAT) x histon deacetylasy (HDAC)    5. Represe transkripce - „pasívní“ represe - „aktivní“ represe (transkripčně-represivní domény) - methylace DNA v oblasti promoteru

Nukleosomy Histony: 2A, 2B, 3 a 4 (celkem 8 molekul histonů)   Histony: 2A, 2B, 3 a 4 (celkem 8 molekul histonů) DNA: 146 bp., necelé 2 otáčky kolem histonového jádra + cca 40 bp. spacer změny ve struktuře histonů: acetylace/deacetylace histonů, "remodelace" multiproteinovými komplexy - význam při transkripci

Acetylace a deacetylace nukleosomových histonů

Acetylace a deacetylace lysinového zbytku v histonech

Acetylace a deacetylace histonů HAT = histon acetyltransferasa HDAC = histone deacetylasa

Modifikace lokálního chromatinu na promoteru

Transkripční faktor „rekrutuje“ nukleosomy-remodelující komplex nebo histon acetylasu k promoteru

REPRESE PROTEINOVÝMI FAKTORY (transkripční represory) REPRESE TRANSKRIPCE:   REPRESE PROTEINOVÝMI FAKTORY (transkripční represory)   1. Nepřímá represe (~ specifická represe), represe způsobující inhibici transkripce aktivované transkripčním faktorem (TF) - zablokování vazebného místa pro transkripční faktor na DNA - blokování TF přebytkem represoru = sekvestrace - neutralizace TF v nepřítomnosti „induktoru“ - nadbytek „přemosťovacího faktoru“ v proteinovém komplexu - inaktivace transkripčního kofaktoru/koaktivátoru - vazbou HDAC (histon deacetylasy) v multiproteinovém komplexu 2. Přímá represe (~ obecně účinkující represe), represe blokující funkci basálního transkripčního aparátu - Dr1 x TBP    REPRESE MODIFIKACÍ DNA V PROMOTERU (cis)   - methylace promoteru (methyl-CpG binding proteins) (- mutace)

CpG ostrůvky

IMPRINTING:   Epigenetická modifikace jedné ze dvou alel spojená s rozdílnou transkripční aktivitou (represe transkripce z jedné alely). Nestejná fenotypová prezentace při mutaci/deleci maternální nebo paternální alely. ______________________ Výsledkem může být např. rozdílný fenotyp při genovém defektu na jedné nebo druhé alele. Nejčastějším molekulárním podkladem imprintingu je rozdílná methylace alel.