Biochemie neurodegenerativních chorob a prionů Alice Skoumalová

Neurodegenerativní choroba Patologický protein (amyloid) Alzheimerova choroba β-amyloid Parkinsonova choroba α-synuclein Frontotemporální demence Tau Hungtingtonova choroba Huntingtin Creutzfeldt-Jakobova nemoc Prion

Nemoci způsobené patologickou konformací proteinů Způsobené abnormální terciální strukturou (konformací) specifických proteinů β-skládaný list α-helix konformační změna Normální protein (nativní struktura) Protein způsobující onemocnění (patologická konformace) Agregace Toxická aktivita Ztráta funkce Neurodegenerativní choroby

Ukládání (Amyloidosy) Ubikvitin Ribosom RNA ATP Chaperony Nativní protein Protein s patologickou konformací Agregát/fibrilární amyloid Chaperony Proteasom Ukládání (Amyloidosy) Degradovaný protein Toxická bílkovina (Alzheimerova choroba) Ztráta funkce (Cystická fibrosa)

Struktura amyloidních fibril Rovné, nerozvětvené, velikost 8-16nm Složeny ze 2 až 6 protofilament (3-4 nm) Bohaté na struktury β-struktury (vzájemně spojeny vodíkovými můstky)

Molekulární faktory tvorby amyloidu Destabilizační faktory: Abnormální zavinutí proteinu je klíčové pro tvorbu amyloidu Stabilita proteinu (stálost nativní konformace proti abnormální) je důležitý faktor pro náchylnost k tvorbě amyloidu Destabilizační faktory: 1. Extrémní podmínky prostředí (např. kyselé buněčné kompartmenty) 2. Proteolytické štěpení proteinů (endogenní proteasy) 3. Mutace, které pozmění primární strukturu (mnoho amyloidos má familiární formu způsobenou mutací proteinovém prekursoru amyloidu) 4. Kontakt s lipidovou dvojvrstvou membrán (Aβ)

Kontrola kvality proteinů

Základní patologické znaky provázející Alzheimerovu chorobu Neurofibrilární tangly hyperfosforylovaný tau protein Amyloidní (senilní) plaky fibrily proteinu β-amyloidu (Aβ) abnormální zpracování APP (amyloid prekurzor protein)

Štěpení APP a vznik Aβ

Amyloidní kaskáda - patologie Alzheimerovy choroby Mutace APP, PS1 a PS2 genů Zvýšená produkce a kumulace Aβ42 Oligomerizace Aβ42 a depozice v senilních placích Ovlivnění synapsí oligomery Aβ42 Aktivace mikroglií a astrocytů (komplement faktory, cytokiny) Progresivní poškození synapsí a neuritů Poškození iontové rovnováhy neuronů, oxidační poškození Ovlivnění signálních drah kináz a fosfatáz tvorba tanglů Poškození funkce neuronů a buněčná smrt s deficitem transmiterů Demence

Definice prionů Priony jsou proteinové přenosné patogeny způsobující některé fatální neurodegenerativní choroby (např. u lidí Creutzfeld-Jakobovu nemoc, kuru, u zvířat bovinní spongioformní encefalopatii) Prion je zkratka pro proteinaceous infectious particle (analogie virion); jde o infekční agens, které nenese genetickou informaci uloženou v nukleové kyselině! Priony jsou proteiny s patologickou konformací, které jsou schopny dále propagovat konformační změny nativních proteinů na abnormální struktury

Nemoc Hostitel PrP isoforma Scrapie Ovce, koza OvPrPSc Transmissible mink encephalopathy (TME) Norek MkPrPSc Chronic wasting disease (CWD) Jelen, los MDePrPSc Bovine spongioform encephalopathy (BSE) Skot BovPrPSc Feline spongioform encephalopathy (FSE) Kočky FePrPSc Exotic unguale encephalopathy (EUE) Antilopa NyaPrPSc Kuru Člověk HuPrPSc Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome (GSS) Fatal familial insomnia (FFI)

PrPC PrPSc Název PrPC (cellular) Normální protein Transmembránový glykoprotein (neurony, lymfocyty); funkce není známá; váže Cu2+ (homeostasa těchto iontů) Dominantní sekundární struktura α-helix Dobře rozpustný ve vodě Monomerní, snadno štěpen proteasami Kódován genem zvaným PRNP na chromosomu 20 PrPSc Název PrPSc (scrapie) Abnormální protein způsobující nemoc Stejná sekvence aminokyselin (primární struktura) Dominantní sekundární struktura β-skládaný list Nerozpustný ve vodě Multimerní, rezistentní k působení proteas Když je v kontaktu s normálním proteinem PrPC, konvertuje ho na abnormální PrPSc Tvoří agregáty (způsobují onemocnění a/nebo vznikají jako vedlejší efekt)

Chemická struktura PrPC a PrPSc Gen PRNP na chromosomu 20 Primární translační produkt 253 aminokyselin Posttranslační úpravy: glykosylfosfatidylinositolovou molekulou disulfidický můstek

Molekulární model struktury: PrPC PrPSc Převažuje α-helix (3x) β-skládaný list (40%), α-helix (30%)

Prionové agregáty (snímek z elektronového mikroskopu)

Replikační cyklus Přítomnost iniciálního PrPSc: exogenní (infekce) nebo endogenní (vrozená či sporadická forma) Abnormální protein PrPSc konverguje nativní protein PrPC na PrPSc v replikačním cyklu Patologické PrPSc agregují

Mechanismus progrese prionů

Prionové choroby: vzácné neurodegeneratvní onemocnění (1 nemocný/milion) 1. Sporadické (85 %) U starších lidí, rychlá progrese (1 rok) Př. Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) 2. Familiární (vrozené-15%) Mutace PrP genu způsobí změnu nativní konformace na patologickou PrPSc Př. Gerstmann-Straussler-Scheinkerova nemoc (GSS),fatální familiární insomnie (FFI) 3. Přenosné (velice vzácné, ale mediálně známé) V laboratoři přenosné na myši intrakraniální injekcí mozkového homogenátu nakažených zvířat Přenos nemoci kuru u lidí (domorodci na Nové Guinei-kanibalismus) Nedávno zjištěn přenos BSE na člověka v Evropě po požití infekčního hovězího masa (varianta CJD)

Přenosné spongioformní encefalopatie (TSE)=prionové onemocnění Skupina progresivních chorob, které atakují mozek a nervový systém lidí a zvířat a jsou přenosné priony Patologie: Vakuolární degenerace, ztráta neuronů bez zánětlivé odpovědi, astrocytosa, deposita amyloidů Klinika: ztráta motorických funkcí (poruchy koordinace, ataxie, nechtěné trhavé pohyby), změny osobnosti, deprese, nespavost, zmatenost, poruchy paměti, demence, progresivní svalová paralysa, smrt Definitivní diagnosa: post mortem histologicky Neléčitelné

Přenos prionů Přímý kontakt s infikovanou tkání: např. iatrogenní přenos CJD u pacientů, kterým byl aplikován růstový hormon získávaný z lidské hypofýzy, z instrumentů u mozkové chirurgie (priony přežijí běžnou sterilizaci), rohovkové transplantáty, elektrodové implantáty Konsumpce infekčního masa: např. byl prokázán přenos prionů u nemoci kuru (kanibalismus u domorodců z Nové Guinei) a vCJD (požití masa z krav s BSE) Není znám mechanismus jak se priony dostanou z trávicího traktu do mozku (normálně jsou proteiny tráveny a vstřebávány jako aminokyseliny) Hypotesa: Nejsou tráveny (rezistence k proteasam), jsou transportovány přes lymfatickou tkáň střeva (gut-associated lymphoid tissue GALT)

Typy prionů =subklasifikace prionů na základě strukturálních charakteristik, které definují jejich patologický profil Liší se inkubační dobou a neuropatologickými znaky, i když jsou způsobeny stejným proteinem (PrPSc) Existence různých typů prionů: jsou chemicky identické, ale nemají přesně stejnou konformaci Strukturální charakteristiky jednotlivých prionových typů jsou propagovány přes replikační cyklus Jednotlivé typy prionů mají specifické cílové tkáně, inkubační dobu a patogenezi

Různá inkubační doba a neuropatologie typů prionů různé biochemické charakteristiky odlišnosti jsou zachovány po opakovaném přenosu Charakteristiky jednotlivých typů prionů jsou zachovány po přenosu na jiné druhy -po re-izolaci v původním hostitely

Konsumpce BSE-nakaženého masa Prion BSE Varianta CJD: u mladších, jiný klinický průběh Prion vCJD je identický s prionem BSE Klasická CJD: u starších Prion CJD se liší

Konformační selekce a druhová bariéra Široká škála možných konformací PrPSc Pro jednotlivé druhy termodynamicky možné pouze některé z nich Stejné konformace - možný přenos

Terapeutické strategie 1. Léky, které přeruší replikační cyklus PrPSc Takové léky byly testovány na buněčných modelech, musí být ověřeny na zvířecích modelech a testovány v klinických studiích 2. Vývoj vakcíny: abnormální protein, na rozdíl od nativní formy, exponuje specifické aminokyselinové zbytky; protilátky proti této specifické sekvenci stimulují imunitní reakci proti patologickému prionu 3. Vývoj peptidů rozrušující struktury β-skládaného listu 4. Genová terapie: úprava genu kódujícího priony Genetické inženýrství: kráva s chybějícím genem pro produkci prionů; teoreticky imunní k BSE (prosinec 2006)

Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD) Nejčastější prionové onemocnění Výskyt mezi 55-65 roky (varianta CJD u mladších) Do 1 roku smrt Klinika: Demence, halucinace, poruchy motoriky Diagnosa: Klinické symptomy, EEG, MRI, analysa CSF (nárůst 14-3-3 proteinu) Definitivní diagnosa: histologie mozkové tkáně Léčba: neléčitelná, hledání léků Formy: 1. Sporadická 2. Familiární 3. Přenosná: iatrogenně-iCJD, požitím-vCJD Dárcovství krve: přenos transfuzí, nedá se zjistit u dárců, restrikce pro dárce

Charakteristika Klasická CJD Varianta CJD Věk úmrtí 68 let 28 let Doba trvání nemoci 4-5 měsíců 13-14 měsíců Klinické symptomy Demence, časné neurologické projevy Psychiatrické projevy, pozdější neurologické poruchy, senzorické halucinace Specifický nález na MRI Přítomen Specifický nález na EEG Nepřítomen Imunohistochemie mozkové tkáně Variabilní akumulace PrPSc Významná akumulace PrPSc Nález prionů v lymfatické tkáni Nesnadno detekovaný Snadno detekovaný Přítomnost amyloidních plaků v mozku Přítomny

Kuru (domorodé slovo znamenající „roztřesený zimou a horečkou“) Prionové onemocnění vyskytující se mezi domorodci na Nové Guinei (poprvé diagnostikováno 1900) 1950-60 epidemie Kanibalismus: příbuzní pojídali mozky mrtvých na znamení smutku V 50. letech zákaz kanibalismu kvůli přenosu TSE, koncem 20. století nárůst nemocných (inkubační doba 30-50 let) Symptomy: 3 fáze, postupně se zhoršující motorické a mentální funkce

Závěr Konformační defekt proteinů - nemoci způsobené patologickou konformací proteinů - neurodegenerativní nemoci Oligomerní agregáty patologických proteinů - neurotoxické Priony jsou proteiny, které nesou informaci pro vlastní reprodukci (vyvrácení dogmatu moderní biologie) Priony se nacházejí v membránách u zdravých lidí a zvířat, ale jejich abnormální konformace (PrPSc) jsou nerozpustné, nedají se štěpit a agregují PrPSc atakuje nativní prion PrPC, změní jeho konformaci na abnormální, způsobí exponenciální nárůst nerozpustných proteinů, které agregují a tvoří fibrilární struktury Prionové choroby jsou vzácné neléčitelné degenerativní poruchy, některé z nich jsou přenosné, ale mechanismus není úplně jasný (např. přenos BSE na člověka)