Transkripce RNA processing Translace 3. Genová exprese I Transkripce RNA processing Translace

Genová exprese Definice (pro naše účely): Syntéza funkčního proteinu (nebo RNA) podle informace v DNA Princip: Sekvence DNA → Primární struktura proteinu → Terciální struktura proteinu → Funkce Proces: 1. Transkripce (DNA → RNA) 2. Úprava RNA (zejména u eukaryot, celá řada procesů) 3. Translace (RNA → protein) 4. Folding, sorting, posttranslační úpravy

Fáze genové exprese Genová exprese u eukaryot (transkripce - translace) Různé geny jsou exprimovány s různou intenzitou (v závislosti na potřebách buňky)

3.1 Transkripce Syntéza ssRNA podle předlohy (DNA) Princip komplementarity bazí (A=U, T=A, C≡G, G≡C) 5´ → 3´ směr Je asymetrická (pouze [-] vlákno DNA) Není třeba primer Lokalizace: Eukaryota: jádro, semiautonomní organely Prokaryota: cytoplazma

Druhy RNA Kódující x nekódující (funkční, strukturní) Ribozym - katalytická RNA Hypotéza RNA světa

Enzymatický aparát RNA polymeráza (více podjednotek) Transkripční faktory Promotor: sekvence DNA iniciující transkripci Terminátor: sekvence DNA ukončující transkripci Promotor a terminátor vymezují transkripční jednotku RNA polymeráza: Rychlost E. 20 nt/s P. 50 nt/s Chyby 10-5

RNA polymeráza (cyklus) 1. Vazba RNA pol. 2. Otevření DNA dvojšroubovice (vyžaduje/nevyžaduje ATP) 3. Abortivní iniciace (syntéza krátkých RNA molekul) 4. Promoter clearance – počátek syntézy transkriptu, elongace 5. Terminace transkripce, odpadnutí RNA pol. VIDEO

Produkt transkripce: RNA 1. Funkční RNA: rRNA (80 %), tRNA (15 %), snRNA, snoRNA, miRNA, 7SL RNA atp. (ribozymy) (stabilní) 2. mRNA (4 %): Eukaryota: 5´ nepřekládaná oblast Překládaná oblast = ORF (1 protein) 3´ nepřekládaná oblast Úprava konců (5´ čepička, 3´ ocásek) ½-čas života 30 min až 20 hodin Prokaryota: Polycistronní transkript (operon) 1 molekula mRNA kóduje více proteinů ½-čas života 2 až 3 min

3.1.1 Bakteriální transkripce Jeden typ RNA polymerázy σ faktor (σ70 + stresové σ ) : iniciace, vazba RNA pol. -35 a -10 konsensus (-10 = Pribnowovův/TATA box) TTGACA TATAAT

Bakteriální transkripce II Terminace 1) ρ nezávislá Vlásenka (GC) (invertovaná repetice) Na konci oligo(U) – uvolnění RNA 2) ρ (Rho) závislá Hexamer ρ, vytáhne transkript Signální C bohatá sekvence Spotřeba ATP Transkripce a translace probíhají současně

3.1.2 Eukaryotická iniciace transkripce 3 druhy polymeráz (podle typu RNA) RNA polymeráza II – syntéza mRNA Transkripce a translace prostorově a časově odděleny Transkripční faktory: obecné (GTFs), speciální DNA vazebná, aktivační a regulační doména GTFs nasedají v definovaném sledu (D, A, B, E, H, F + RNA pol.) Fosforylace CTD (carboxy terminal domain) TFIIH – helikázová aktivita (spotřeba ATP)

Eukaryotická iniciace transkripce II In vivo jsou pro iniciaci důležité další proteiny: A) Chromatin: Histon acetyláza = modifikace histonů Chromatin remodeling complex = uvolnění DNA z chromatinu B) Vzdálené elementy: Enhancer = vzdálená aktivační sekvence DNA, interakce s TF, HAT Mediátor = proteinový komplex

3.2 RNA processing U mRNA pouze u eukaryot (sestřih i Archea) "Capping" Polyadenylace Sestřih (splicing) Transport z jádra Kontranskripčně, kontrola kvality (pro translaci)

Čepička, poly(A) ocásek Cap = 7-methylguanosin Poly(A) ocásek - terminace transkripce Funkce = značka (vše je v pořádku, kontrola kvality): Transport, ochrana proti degradaci,translace Primární transkript (hnRNA) - komplex s proteiny a) b) c) d)

Sestřih U kvasinek vzácný, u savců velmi častý Intron - úsek, který se vyštěpí (degradace), není nikdy překládán Exon - úsek, který jde z jádra (může a nemusí být překládán - viz UTR) Introny jsou vymezeny určitou sekvencí (GU...A...AG) Více mechanismů (zde uveden nejrozšířenější) 1. Lariátová struktura (2´ transesterifikační reakce, branching point A, 5´ - 2´ vazba) 2. Spliceosome: ribozymy (snRNA) (existuje i self-splicing) Alternativní sestřih: více variant sestřihu (i mRNA, proteinu) Funkce: nejasná (alternativní sestřih) evoluce nových genů

Alternativní splicing Spliceosome VIDEO

Transport mRNA z jádra Export jaderným pórem Mnoho mRNA vazebných proteinů zůstává v jádře Role čepičky (i ocásku) Musí být správně sestřižena - proteiny vážící exon/exon hranice

Lidský apolipoprotein B RNA editing Posttranskripční úprava sekvence mRNA (změna informace) Není příliš rozšířený (ale i u nepříbuzných druhů) Člověk: deaminace (C→U, A→I), substituce Trypanosoma - mitochondrie: gRNA - inzerce, delece Význam: nejasný (evoluční oportunismus), alternativní editing Lidský apolipoprotein B N-koncová doména Trypanosoma (kinetoplast) inzerce, delece U

Úprava funkčních RNA: rRNA rRNA (E: 18S, 5.8S, 28S, 5S x B: 16S, 5S, 23S): více (i u eukaryot), sestřih (i u prokaryot) snoRNA, RNáza P atp. (ribozymy i proteiny) modifikace (pseudouridin), 2´ O methylace jadérko (struktura v jádře) Tvorba malé i velké ribozomální podjednotky export z jádra

Úprava funkčních RNA: tRNA Sestřih (ne vždy) - štěpení + ligace (odlišný od mRNA!) Modifikace konce (CCA), modifikace bazí RNáza P, nukleázy, ligázy Jadérko

3.3 Translace Syntéza proteinu (překlad informace mRNA → protein) Aparát (složitý): tRNA, rRNA (ribozómy), celá řada enzymů Mimoribozomální fáze (aktivace tRNA - vazba AMK) Ribozomální fáze (elongace proteinového řetězce) Cytoplazma, SA organely VIDEO Čtecí rámec Genetický kód: Tripletový (triplet = kodón) Degenerovaný (43 = 64, kódovaných aminokyselin je 20 + STOP) Univerzální (+/-, známé odchylky: mitochondrie, C. albicans)

Mimoribozomální fáze translace Vazba tRNA a AMK (aktivace tRNA) (3´ OH nebo 2´ OH) Aminoacyl-tRNA syntetáza (pro každou AMK min jedna) Opravná (proofreadingová) aktivita (celk. chybovost 10-5) Energie: 2 makroergní vazby (ATP→AMP ≡ 2ATP →2ADP)

Ribozóm Malá a velká podjednotka Komplex rRNA (2/3) a proteinů (1/3) (katalytická funkce rRNA) Důležitá místa na ribozómu: mRNA vazebné místo Aminoacylové místo Peptidylové místo Exit VIDEO

Ribozomální fáze translace Princip: tRNA (antikodón) páruje s kodónem Vznik peptidické vazby Fáze: Iniciace (rozdíl bakterie x eukaryota) Elongace Terminace Směr: N → C konec Elongace

Bakteriální iniciace translace RNA nemá upravené konce, polycistronní 1. Sekvence Shine-Dalgarno (-10 b) na mRNA Vazba 30S podjednotky (komplementární k 16S rRNA) 2. Iniciátorová tRNA (N-formylmethionin) - vazba na AUG kodón 3. Vazba 50S podjednotky Iniciační faktory (IF-1,2,3), GTP Ribozóm může nasednout na více místech Signál pro iniciaci transkripce

Eukaryotická iniciace translace mRNA má upravené konce, monocistronní 40S podjednotka váže iniciátorovou tRNA (met) Vazba 40S na 5´ konec mRNA 40S hledá první START kodón (AUG) Vazba 60S podjednotky Iniciační faktory (eIF-2, 4E, 4G), GTP, ATP *IRES Internal Ribosomal Entry Site Alternativní způsob iniciace

Translace: Elongace (B. i E.) VIDEO Tvorba peptidické vazby, prodlužování řetězce Spotřeba GTP (posun ribozómu) Elongační faktory: EF-Tu (1α) - Přináší tRNAn GTP→GDP - disociace EF-Ts (1βγ) - Nabíjí EF-TU (GDP→GTP) EF-G (2) - vazba do A místa: tRNAn jde do P místa, tRNAn-1 exit VIDEO Polyribozóm

Translace: Terminace Terminační faktory (Release factors): RF1,2,3 (eRF1,3) (GTP) Váží se na STOP kodóny (v P místě), hydrolýza tRNAn-1-peptid Uvolnění ribozómu Molekulární mimikry

Degradace mRNA Poly(A) má ochrannou funkci Kompetice mezi translací a degradací mRNA

Aminokyselina 21. - selenocystein Selenocystein: stop kodón (UGA) + další signál | (pyrrolysin) Zlomená mRNA: ribosome rescue tmRNA - tag, uvolnění ribozómu Eukaryota: poškozená RNA se vůbec neiniciuje

Shrnutí Genová exprese = Transkripce (RNA pol.) regulační elementy transkripční jednotky 2. RNA processing mRNA (eukaryota) tRNA, rRNA (E. i P.) 3. Translace (ribozómy) mimoribozomální fáze (ATP) ribozomální fáze (GTP) iniciace = nalezení 1. kodónu 4. Dále: posttranslační osud proteinů Rozdíly: Bakterie vs. eukaryota VIDEO Souvislosti: Posttranslační osud proteinů

Bakteria x Eukaryota Odlišnosti se týkají především podoby mRNA a odvozených procesů Rozdílné složení (ne funkce) ribozómů - antibiotika Důvod = odlišné životní strategie: Bakterie - maximální reprodukce, rychlá odpověď na podnět, vnější podněty, nižší diverzita proteinů (stres, živiny) 2) Nižší eukaryota - určitá přechodová strategie 3) Metazoa - regulovaná reprodukce, kvalita odpovědi (spolupráce buněk, synchronizace), vnitřní podněty, evoluční náplava (ne všechny procesy a struktury jsou adaptivní), hodně různých proteinů (nutnost kompartmentace) Souvislosti: Regulace genové exprese

Bakteria x Eukaryota Bakterie Eukaryota Účel (E.) RNA pol. 1 typ 3 typy regulace RNA processing Transkripce a translace současně odděleny úprava mRNA nutnost (jádro) mRNA polycistronní monocistronní jemnější regulace kontrola kvality Úprava konců RNA ne ano Splicing + editing Každý proces/struktura/regulační obvod zvyšuje počet proteinů (genů) v buňce. Každý gen zatěžuje buňku (energie na expresi a replikaci, nové možné interakce atp.)

Poznámky Nestíhá se - vynechat speciality - editing, apod. Některé speciality přesunout k virů - např. ires Funkce a struktura