Struktura a fold proteinů Petr Kolenko

β-domény funkčně nejrozmanitější skupina proteinů jádro tvořeno 5 až 10-ti i více β-listy - převážně antiparalelní převážně dva β-skládané listy sbalené na sebe, nebo β-barrel Tři nejčastější topologie: nahoru-dolů barrely Řecké klíče roládové barrely

Nahoru-dolů barrely (up-and-down) nejjednodušší topologie Retinol vázající protein: okolo 180 aminokyselin váže retinol a dopravuje ho pomocí dalších mechanismů z jater (skladování) do potřebných tkání jeden protein na jednu molekulu degradován po ukončení funkce vazebné místo v nenavázaném stavu prázdné - bez vod 8 antiparalelních β-listů z jedné strany obklopené α-šroubovicemi Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

Vrtulové struktury (propeller-like) Neuraminidasa chřipkového viru 6 β-skládaných listů do tvaru vrtule prostřední smyčky vytváří aktivní místo z jedné strany proteinu obecně je možné více “listů” vrtule po infekci zdravých buněk katalyzuje odštěpení sialové kyseliny na povrchu nakažené buňky - signalizace pro virus, že buňka je již nakažená - není třeba znovu vynakládat energii k tomu ji nakazit Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

Glykosylace bílkovin http://www.jenabioscience.com/images/d5d8982b86/glycosylation.gif

Glutaminyl cyklasa PDB: 3NOK PDB: 3PBB Zn2+ Myxococcus xanthus Homo sapiens Jiný organismus, jiná struktura, jiný mechanismus enzymatické katalýzy, stejná funkce!

Domény z motivu Řeckého klíče γ-crystallin - protein očních čoček monomer, dvě domény každá doména tvořena dvojicí Řeckých klíčů motiv evolučně vznikl fúzí dvou motivů genomu k utvoření jedné domény, následně duplikací domén sekvenční homologie je vyšší při přeložení domén, než při přeložení jednotlivých motivů uvnitř domény Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999. Motiv rolády - příklad Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999. Coat protein of satellite tobacco necrosis virus PDB: 2BUK

Paralelní β-šroubovice PDB: 1AIR Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

Nestrukturované proteiny aglutinin z pšeničných klíčků většina aminokyselin se nepodílí na vytváření sekundární struktury téměř žádné hydrofobní jádro obvykle velmi strukturně flexibilní proteiny - adaptace PDB: 9WGA

Proteiny se skládají z domén Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

Domény mohou mít různé funkce Strukturu CDH se zatím nepodařilo určit pomocí rentgenové difrakce. Podobné domény homologních proteinů jsou však již známy. Velká flexibilita má nejspíš za následek špatný růst kvalitních krystalů pro difrakční experiment. http://pubs.rsc.org/services/images/RSCpubs.ePlatform.Service.FreeContent.ImageService.svc/ImageService/Articleimage/2008/CP/b808859d/b808859d-f1.gif

Záměna domén - domain swapping evoluční jev tvorba nových aktivních míst na rozhraní domén větší vazebné povrchy alosterie vyšší koncentrace aktivních míst ekonomický způsob tvorby velkých interakčních sítí

Folding a flexibilita proteinů proces nabývání své funkční struktury spontánní vs. asistovaný (enzymy, ale i nízkomolekulární látky, prvky) jeden i více kroků jedna i více drah správného foldingu chaperon - třída proteinů asistující při správném sbalení struktury Natavená globule - částečně sbalený stav, blízký konečné funkční struktuře. Proteiny ve svém nativním stavu nejsou rigidní, nachází se v roztoku, mnoho částí flexibilních. Mnoho proteinů vyžaduje změnu struktury ke své funkci!

Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999. Folding Stabilitu (nativní stav) ovlivňuje: teplota pH přítomnost aditiv v rozpouštědle redukující vs. oxidující stav náboj světlo Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999. Srovnávací studie pomocí monokrystalové difrakční analýzy a NMR ukazují, že molekuly mají dominantní fold, který je v roztoku přítomen - stav s nejnižší volnou energií.

Mezikroky ke správné struktuře nejdříve tvorba hydrofobního jádra (největší snížení volné energie ve srovnání s tvorbou sekundární struktury) dramaticky snižuje množství konformací tvorba sekundární struktury je až následek, neboť i polární hlavní řetězec musí být minimalizován, pokud je uvnitř hydrofobní oblasti Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999. Energetická bilance Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999. Některé proteiny (např. barnasa) mají pouze jeden způsob nabývání funkční struktury, zatímco další enzymy (např. lysozym) mohou paralelně procházet odlišnými “cestami” v nabývání výsledné struktury.

Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999. Tvorba S-S můstků u bakterií v periplasmě, katalyzováno enzymy Dsb - disulphide bridge-forming enzyme, v cytoplasmě cysteiny redukované u eukaryotických buněk ke tvorbě dochází v endoplasmatickém retikulu před transportem ven z buňky, katalyzováno enzymem protein disulfide isomerase - PDI Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

Chaperony proteiny podílející se na sbalování (folding) dalších proteinů mohou pomáhat způsoby: 1) pomáhají při sbalení proteinů 2) zabraňují sbalit se předčasně 3) zabraňují sbalit se nesprávně 4) chrání dočasně exponované hydrofobní oblasti nesbalených proteinů před interakcemi s dalšími molekulami a tak k jejich precipitaci (srážení) 5) upravují vlastnosti okolního prostředí - roztoku některé spotřebovávají ATP jako zdroj energie - obsahují ATPasovou doménu některé z nich indukovány zvýšenou teplotou, během které také dochází k degradaci a rozbalování proteinů - např.Hsp70 - protein o MW 70 kDa

GroEL-GroES (Escherichia coli) komplex 14-ti jednotek GroEL (60 kDa) a 7-mi jednotek GroES (10 kDa) - chaperonin vážou mezistavy při sbalování, ale ne nativní proteiny široké spektrum různých sekvencí ATP esenciální pro funkci (vázáno do ekvatoriální domény) flexibilní oblasti (pravděpodobně podílející se na funkci chaperonu nejsou pozorovány pomocí rentgenové difrakce (běžné) - úseky okolo 30-ti aminokyselin Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

GroEL a GroES obsahuje převážně hydrofobní oblasti, váže rozbalené oblasti, je flexibilní - široké spektrum funkce představuje pohyblivou adaptabilní doménu strukturní základna, báze převážně α převážně β

Navržený mechanismus funkce http://www.biochem.mpg.de/1168144/GroEL_GroES_Cycle.jpg Sbalený stav neznamená rigidní strukturu! Atomy fluktuují díky teplotě okolí, i funkční proteiny mohou procházet výraznými strukturními změnami a změnami konformací domén.

Stabilita struktury bílkovin Struktura není statická! Existují stupně volnosti - konformační adaptibilita. Calmodulin všudypřítomný vápník vázající protein - signální dráhy váže se na kinasy, vápníkové pumpy, apod. převaha šroubovic dvě stabilní oddělené domény velká konformační změna zasahuje malý počet reziduí Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

Serpin - inhibitor serinových proteas Infekce plic → akumulace aktivovaných leukocytů, které produkují takové enzymy, které jsou schopny odstraňovat poškození způsobené infekcí (např. elastasa neutrofilů - serinová proteasa). Mechanismy je třeba regulovat - skrze inhibitory jako α1-antitrypsin (inhibuje i jiné proteasy, např. trypsin). Inhibice proteasy se děje skrze těsnou vazbu části serpinu do aktivního místa proteasy. Po uvolnění komplexu dochází ke štěpení smyčky serpinu. Branden & Tooze, Introduction to Protein Structure, 1999.

Serpin - struktura tři antiparalelní β-listy, obklopeny několika α-šroubovicemi konverzi z aktivní do štěpené formy provází dramatická změna v uspořádání - rozpletení β-listu a mnoha vodíkových můstků včetně změny hydrofobního vnitřku molekuly latentní forma neaktivní přechod z aktivní do latentní formy spontánní, přechod z latentní do aktivní vyžaduje kompletní refolding bílkoviny

Propeptidy, prekursory bílkovin často neaktivní formy bílkovin, které mohou být uvedeny do aktivní formy štěpením, nebo např. nějakou post-traslační modifikací u enzymů: proenzym časté signální sekvence určující cílovou tkáň dané bílkoviny, během procesu přenosu bývá signální sekvence odštěpena příklad: trypsinogen - trypsin 1 245 1 15 16 245

HIV-1 proteasa enzym důležitý pro životní cyklus viru HIV štěpí nově vytvořený polyprotein (kódovaný pomocí ssRNA) virus bez HIV-proteasy není životaschopný PDB: 1ZSR aktivní místo http://hivbook.files.wordpress.com/2011/11/figure-11.jpg

Bakteriální exprese škálovatelná nízké náklady jednoduché podmínky jednoduchá manipulace snadná reprodukce disulfidové můstky? obtížná produkce eukaryotních proteinů rozpustnost glykosylace? http://www.amsbio.com/images/pagelayout/bacterial-expression-draw.jpg

Exprese v kvasinkách eukaryotické proteiny škálovatelné - fermentace jednoduchá média snadná manipulace glykosylace, S-S můstky exprese dovnitř i ven z buněk fermentace často nutná zdlouhavá optimalizace podmínek

Exprese v hmyzích buňkách glykosylace podobná savčímu typu vyšší výtěžky než u savčích systémů nákladnější provoz - média dlouhá expresní doba snadná kontaminace http://www.thesgc.org/sites/default/files/Biotech%20018.jpg

Exprese v savčích buňkách správná glykosylace, tvorba S-S můstků nejvyšší pravděpodobnost zisku plně funkčních lidských či savčích proteinů snadná kontaminace nízké výtěžky náklady na média http://media.biocompare.com/m/37/Category/6533-187x140.jpg

Heterologní exprese proteinů “Cell-free exprese (in vitro) škálovatelná jednoduchá rychlá exprese - přímo z plasmidu jednoduché přidání dalších komponent rozmanitý buněčný původ produkce malého množství vysoké náklady https://chemicalengineering.byu.edu/gradpages/gradpic/smithresearch.jpg

Alternativní metody izolace z cílového organismu přímá syntéza plně funkční stav (u izolace) malý výtěžek vysoké náklady Téměř u všech metod vyvstává etická otázka, je-li použití metody opodstatněné.