Regulace transkripce u prokaryot Regulace transkripce u prokaryot - kapitola 16 Restrikční enzymy - kapitola 5 Molekulární klonování – kapitola 4 a 5

Proč je nutné kontrolovat expresi genů? Buňka potřebuje vyrábět různé proteiny v závislosti na buněčném cyklu, prostředí atd. Buňka produkuje různé produkty Např. lidský organismus obsahuje 200 typů buněk, celkem 37.2 trillionů buněk, všechny maji stejnou genetickou výbavu, přesto dělají různé věci Jednobuněčný organismus reguluje expresi svých genů v závislosti na změně prostředí (teplota, osmolarita, zdroj látek), či vnitřních signálů (příprava na dělění apod.) Regulace probíhá na mnoha úrovních: Na úrovni transkripce primárního transkriptu Na úrovni úpravy primárního transkriptu Na úrovni stability transkriptu Na úrovni translace Na úrovni úpravy a sbalení peptidového řetězce do funkčního proteinu Na úrovni kontroly aktivity proteinu Na úrovni degradace proteinu

Efektivní vs. rychlá regulace Efektivní regulace je na úrovni transkriptu Vyžaduje méně energie Rychlá regulace je na úrovni proteinu Protein je vždy připraven plnit svou funkci

Regulace exprese genů E.coli Ze 4000 genů je exprimováno v každý okamžik alespoň 1000 Dle podmínek, geny jsou zapnuty a vypnuty Změna teploty  změna exprese 50-100 genů Figure 16.1 2D Protein Gels of E. coli under Different Conditions E. coli was grown in 50 mM acetate or 20 mM formate. Three gels were run for each condition and the Figure shows a layered view of two three-gel composites. The pink and green spots are proteins induced in acetate or formate, respectively. The circled spots are those that were statistically validated, based on a pair-wise comparison of all the individual gels. (Credit: Joan L. Slonczewski and Christopher Kirkpatrick, Kenyon College, Gambier, Ohio.)

Proteiny regulující genovou expresi Jak najdeme proteiny, které regulují genovou expresi? Je nutné najít mutanty pro Regulační proteiny, které kontrolují aktivitu strukturních genů Regulační elementy, jenž fungují v cis a trans pozici Genetická analýza baktérií v 50. letech 20. století identifikovala první proteiny regulující genovou expresi (transkripční faktory) Francois Jacob, Jacques Monod, Andre Lwoff – Nobelova cena v roce 1965 Příklady lac operon lamda ( ) represor

Pozitivní vs. negativní regulace Gen se nepřepisuje, pokud není aktivován AKTIVÁTOR Negativní Exprese genu je pozastavena dokud není represor vyvázán REPRESOR TEST

Alosterická regulace Aktivátor – transkripční faktor, nutný pro expresi genu Represor – vypíná expresi genu U pozitivní regulace – aktivátor nutný pro zapnutí exprese, obvykle se váže upstream od promotoru U negativní regulace – represor neumožňuje transkripci dokud není vyvázán, obvykle se váže downstream od promotoru Indukční činidlo (inducer/effector) Obvykle malá signální sloučenina (živina) váže se na aktivátor/represor a aktivuje jeho funkci

Operon Kluster genů pod jedním promotorem Polycistronická mRNA Francois Jacob and Jaques Monod – poprvé definovali operon – negativně regulovaný laktózový operon

lac operon Zodpovědný za katabolický metabolismus laktózy lac operon – strukturní geny lacZ – β galaktosidáza lacY – permeáza laktózy lacA – acetyláza laktózy (není esenciální) lacI – represor upstream of lacAYZ Transkripce probíhá v opačném směru lacO - operátor TEST

lac operon – transkripce je OFF Při absenci laktózy v prostředí/médiu

lac operon – transkripce je ON Za přítomnosti laktózy v prostředí/médiu

Genetické experimenty, jenž vedly k charakterizaci regulace lac operonu Francois Jacob a Jaques Monod experimenty odhalily podstatu genové exprese Předpoklady pro studium genové exprese: Detekce mRNA Detekce aktivity proteinu Podmínky, ve kterých hladina exprese se různí (indukce) Možnost diploidního organismu – u baktérií vyřešeno pomocí F‘ plasmidu Mutace, které eliminují aktivitu enzymu budou nejspíše změny ve strukturním genu ( Z- a Y-) Mutace ovlivňující inducibilitu budou nejspíše mutace ve regulačních oblastech DNA (Oc) a regulačních genech (I-, IS) Trans-acting Cis-acting

KONSTITUTIVNÍ MUTACE O+/Oc Genetické experimenty, jenž vedly k charakterizaci regulace lac operonu KONSTITUTIVNÍ MUTACE O+/Oc Operátor funguje pouze v pozici cis a tudíž je to místo na DNA, nikoliv protein.

KONSTITUTIVNÍ MUTACE I+/I- Genetické experimenty, jenž vedly k charakterizaci regulace lac operonu KONSTITUTIVNÍ MUTACE I+/I- Figure 10-9 Represor funguje i v pozici trans – tudíž je to protein, který volně přistupuje k oběma DNA

Alosterická regulace I+/IS (super-represor) Genetické experimenty, jenž vedly k charakterizaci regulace lac operonu Alosterická regulace I+/IS (super-represor) Represor je alostericky regulován přítomností/absencí laktózy

Globální regulace lac operonu lac operon je ON pokud je v prostředí přítomna laktóza lac operon je OFF pokud je v prostředí přítomna laktóza a glukóza zároveň CAP protein (catabolite activator protein) encoded by the crp gene

cAMP-CAP complex cAMP je signál, že buňka má málo glukózy CAP zapíná geny pro metabolismus maltózy, laktózy a dalších cukrů při absenci glukózy Propojení negativní (lac I) a pozitivní (cAMP-CAP) kontroly exprese genů!!

Positivní a negativní regulace najednou Shrnutí lac operonu Positivní a negativní regulace najednou

araBAD operon Operon kódující geny, které jsou zodpovědné za katabolický metabolismus arabinózy araC – regulační protein kontrolující transport a metabolism arabinózy araBAD (metabolismum) a araFG (transport, uptake) geny jsou reprimovány AraC při absenci arabinózy, a aktivovány při její přítomnosti

araBAD operon AraC je aktivátorem a represorem zároveň (2 různé konformace) Aktivátor - když je přítomna arabinóza Pomáhá rozeznat oblast a vazbě na DNA Represor – když není přítomna arabinóza Brání vazbě RNAP na promotor Brání posunu RNAP vpřed

Negativní represibilní regulace trp operonu Operon pro syntézu tryptofanu – trpEDBCA 2 mechanismy regulace transkripce trp operonu: Globální kontrola celého operonu (přítomnost/absence tryptofanu) Doladění exprese (vysoká /nízká hladina tryptofanu)

Negativní represibilní regulace trp operonu

Negativní represibilní regulace trp operonu – atenuace transkripce TrpL – leader 160bp Sekvence 1,2,3,4 – mohou vytvořit vlásenku Obsahuje velmi vzácné kodóny pro Trp Atenuace Není to on/off Translace je vyladěna na přítomnost tryptofanu U prokaryot k translaci může docházet ihned po zahájení transkripce Propojení transkripce a translace za účelem regulace genové exprese

Negativní represibilní regulace trp operonu - atenuace TrpL – leader 160bp Sekvence 1,2,3,4 – mohou vytvořit vlásenku Obsahuje velmi vzácné kodóny pro Trp Atenuace Není to on/off Translace je vyladěna na přítomnost tryptofanu U prokaryot k translaci může docházet ihned po zahájení transkripce Propojení transkripce a translace za účelem regulace genové exprese

lamda ( ) represor reguluje přechod mezi lytickým a lysogenním cyklem fága Exprese fágových genů je ON Exprese fágových genů je OFF Exprese fágových genů je ON

lamda ( ) represor reguluje přechod mezi lytickým a lysogenním cyklem fága

Organizace genomu fága je stěžejní pro regulaci exprese genů cro gen – reprimuje lysogenní cyklus, podporuje expresi genů pro lytický cyklus, váže se na PRM cI - represor - reprimuje lytický cyklus, váže se na PRM cII gen – aktivátor, váže se na PRE a aktivuje expresi cI cIII – stabilizuje cII

LYTICKÝ CYKLUS cro je ON, cI je OFF

LYSOGENNÍ CYKLUS cro je OFF, cI je ON

Lysogenní vs. Lytický cyklus – vazba na sekvenci operatoru Figure 10-27

 - represor a cro jsou DNA vázající se proteiny v konformaci „helix-turn-helix“ Figure 10-28

Vedlejší řetězce aminokyseliny jsou zodpovědné za specificitu vazby Figure 10-29

DNA vázající proteiny v konformaci „Helix-turn-helix“ První identifikovaný motiv Nachází se ve stovkách různých DNA vazebných proteinů U eukaryot a prokaryot 2 helixy s krátkým řetezcem mezi, mají fixní úhel C´ helix je důležitý pro vazbu a specificitu

DNA vázající se protein se vážou především do velkého žlábku DNA

DNA vázající se protein se vážou především do velkého žlábku DNA

Příklady proteinů regulující genovou expresi a DNA, kterou váží

DNA vázající proteiny v konformaci „Helix-loop-helix“ První helix je krátký, následuje dlouhá smyčka a dlouhý helix Vazba na DNA rozdílná od HTH motivu Tvoří homodimery, nebo heterodimery

Další typy DNA vazebných proteinů Proteiny obsahující zinc finger motif Proteiny obsahující strukturu β-listu (Met represor) Proteiny obsahující smyčku, jenž se váže do velkého i malého žlábku DNA (p53) Leucinové zipy

Extracytoplasmic heatshock  - faktory Kontrola iniciace transkripce pomocí  - faktorů  podjednotka RNAP rozeznává promotor Alternativní  faktory Sigma factor Jméno Consensus sequence -35 mezera -10 Housekeeping 70 RpoD TTGACA 16-18 TATAAT Stationary phase 38 RpoS CCGGCG CTATACT Nitrogen control 54 RpoN TTGGNA 6 TTGCA Flagellar motion 28 FliA CTAAA 15 GCCGATAA Heat shock 32 RpoH CTTGAA 13-15 CCCCATNT Extracytoplasmic heatshock 24 RpoE GAACTT 16 TCTGAT

 faktor tepelného šoku – RpoH a RpoE Při vysoké teplotě  proteiny se špatně balí, ztrácí svou funkcí  agregují E.coli 37°C – OK 43° - pořád OK 46°C -  exprese heat shock proteinů (30% z celkového množství proteinů) Chaperony (pomáhají správně sbalit protein) Proteázy (degradují špatně sbalené proteiny)

 faktor tepelného šoku – RpoH a RpoE 30°C – není potřebný, je rychle degradován 42°C - protein je stabilní,  se jeho exprese 50°C – aktivace exprese dalších heat shock genů, RpoH je posléze inaktivován Transcripce RpoH genu je pod normálním promotorem (70), jenž je neaktivní při teplotě nad 50°C RpoE tento  faktor umožňující transkripci RpoH i při teplotě nad 50°C. Transkripce je ukončena pri 57°C, kdy RNAP se stává nefunkční

Formace spory u Bacillus Kaskáda alternativních  faktorů Když je nouze o výživné látky  sporulace  faktory důležité pro vytvoření spóry E a K – v mateřské buňce Pre- E – environmentální signály zapínají expresi F a G – ve sporulující buňce F – transkripce ranných sporulujících genů (aktivují pre-E) G – transkripce pozdních sporulujících genů (aktivují pre–K)

Anti-sigma a anti-anti-sigma faktory Anti-sigma faktory se vážou na  faktory a zabraňují nasednutí na promotor SpoIIAB je anti-sigma faktorem pro F SpoIIAA je anti-anti-sigma faktorem a uvolňuje F

Regulon Regulon – skupina genů a operonů, které jsou regulovány jedním regulačním proteinem při spuštění jednoho signálu syntéza argininu ( 12 různých genů/operonů) regulovány jedním represorem Metabolismus cukrů – globální aktivátor cAMP-CAP Alternativní sigma faktory reagující na změnu prostředí

Manipulace s DNA Restrikční a modifikační enzymy Nukleázy DNA nukleázy – Dnázy RNA nukleázy – Rnázy Exonukleázy Buď 5‘ nebo 3‘ specifické exonukleázy Endonukleázy ssDNA dsDNA Specifické (restrikční enzymy) Nespecifické

Restrikční enzymy Vyvinuty jako obrana baktérií proti cizí DNA/RNA (např. viry) Vysoce specifické endonukleázy, rozeznávající 4 až 8 nt Štípou obě vlákna Mechanismus jak rozlišit svou DNA od cizí Methylace (methylázy) adeninu, nebo cytosinu v DNA sekvenci

Restrikční enzymy – typ I Prvně objeveny restrikční enzymy Rozeznávací místo tisíce bp od stěpícího místa Reakce proběhne pouze 1x ATP dependentní 3 podjednotky HsdS - DNA vazebná (rozeznává DNA sekvenci) HsdM – modifikační, methyluje DNA HsdR - enzym - štípe

Restrikční enzymy - typ II Rozeznává specifické místo, aktivita je SPECIFICKÁ Dimer Nepotřebují ATP Potřebují kofaktor (MgCl2) Palindrom (4 – 8 bází) Lepivé konce vs. slepé konce

Restrikční enzymy - typ II Hojně využívány v genetickém inženýrství Rozeznávají „ inverted repeat – PALINDROM > několik stovek enzymů Palindrom 4, 6 či 8 nukleotidů Isoschizomery: NarI BbeI EheI KasI GGCGCC CCGCGG

Restrikční enzymy - typ II Organismus Sekvence HpaI Haemophilus parainlfuenzae C/CGG NdeII Neisseria denitrificans /GATC EcoRI Escherichia coli RY13 G/AATTC EcoRV Escherichia coli J62/pGL74 GAT/ATC BamHI Bacillus amyloliquefaciens G/GATCC BglI Bacillus globigii GCCNNNN/NGGC NotI Nocardia aotidis-caviarum GC/GGCCGC DraII Deinococcus radiophylus RG/GNCCY

Restrikční enzymy - typ II Uplatnění lepivých konců při klonování

Analýza polymorfismu restrikčních fragmentů - RFLP Identifikace organismu Forénzní genetika Určování otcovství

Využití restrikčních enzymů - klonování Molekulární klonování PCR Ligace do PCR vektoru Restrikční analýza Ligace do jiných vektorů Použití: KNOCK-OUT KNOCK-IN Exprese genů - proteinů

Klonování PCR produktu XL-1 cells are tetracycline resistant. XL1-Blue cells are endonuclease (endA) deficient, which greatly improves the quality of miniprep DNA, and are recombination (recA) deficient, improving insert stability. The hsdR mutation prevents the cleavage of cloned DNA by the EcoK endonuclease system. The lacIqZΔM15 gene on the F´ episome allows blue-white color screening. pGEM-T easy (Promega) XL1-Blue Genotype: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)].

Modro-bílá selekce V laboratoři při klonování Gen je klonován do lacZ genu X-gal Bílé kolonie jsou pozitivní

Ověření úspěšnosti klonování Namnožení pozitivních bílých baktérií Izolace plasmidové DNA Restrikční analýza Agarózová gelová elektroforéza Ethidium bromide (interkalační činidlo)

Ověření úspěšnosti klonování PCR Klonování do PCR vektoru Klonování do specifického vektoru

Southern blot analýza – přenos na membránu Jedna z nejpoužívanějších metod molekulární biologie E.M Southern (1975) Přenos DNA molekul na membránu nylonovou nebo nitrocelulozovou membránu Identifikace specifického restrikčního fragmentu Western blot – detekce proteinů Northern blot – detekce RNA

Southern blot analýza – detekce pomocí radioaktivní próby Hybridizace: Vytvoření značené (radioaktivně) próby Náhodné hexa – deca primery [-32P] dATP* dCTP, dTTP, dGTP DNAPI – Klenow fragment

Southern blot analýza – detekce pomocí radioaktivní próby Hybridizace: Vytvoření značené (radioaktivně) próby Inkubace s membránou Vyvolání na rentgenový film

Důležité pojmy k zapamatování Aktivátor Lambda represor Represor Cro a cI Promotor Operon Operátor Polycistronická RNA Alosterická regulace lac operon Pozitivní regulace Indukce Negativní regulace IPTG Alternativní sigma faktor Modro-bílá selekce Atenuace Trp operon Cis-acting Ara operon Trans-acting cAMP Lytický cyklus Lysogenní cyklus