Genové inženýrství Genetická transformace Organizmy Molekulárně biologické studie

Co je genové inženýrství? = cílená změna genetické informace (genomu) Genové inženýrství x klasické šlechtění (mutace, selekce) Využití: Výzkum (studium funkce genů) Medicína (hormony, vakcíny) Genová terapie Zemědělství Průmysl (exprese enzymů) Principy: 1.Přidání genu 2.Delece genu (knock-out) 3.Výměna genu (knock-in)

Horizontální genový přenos Transfer genu z jedné buňky do druhé (ne v přímé linii) Přirozeně: Bakterie - transformace, transdukce, konjugace Eukaryota - SAO→jádro, paraziti Genové inženýrství - aspekty: Univerzální genetický kód (gen se překládá do stejného proteinu) Rozdílné regulační sekvence (jiná interpretace) (pojistka)

3.1 Genetická transformace = vnesení cizorodé DNA (vektoru) do organizmu Tři související otázky: 1.Co transformuji? (vektor) 2.Jak transformuji? (transformační technika) 3.Jak poznám transformované buňky? (selekce) Transformační techniky: Vstup holé DNA (elektroporace, heat shock) Vstup DNA s nosičem (lipofekce, biobalistika) Parazit (virová infekce, Agrobacterium tumefaciens)

DNA vektory 1. DNA bez dalších vlastností (velmi dočasné) 2. Replikační = v buňce se autonomně replikuje 3. Integrační = rekombinuje se do genomu a množí se s ním Náležitosti replikačního/integračního vektoru: 1. Gen (který chci vložit, včetně promotoru, terminátoru) 2. Selekční marker (= také gen) (3. Replikační počátek nebo sekvence zajišťující rekombinaci) Typy vektorů: 1. Plazmidová DNA 2. Virus (virová DNA, RNA u retrovirů) 3. PCR fragment Podvojné (kyvadlové) vektory: Mohou se množit ve více organizmech (bakterie + kvasinky)

Jak namnožit vektor (= DNA) 1. PCR (polymerázová řetězová reakce) 2. V bakteriích

Expresní x neexpresní vektor Neexpresní vektor: Pouze pomnožení DNA sekvence Podvojné vektory (amplifikace v E.coli) Expresní vektor: Exprese genu Promotor + terminátor (transkripce) U bakterií navíc sekvence Shine-Dalgarno

Selekce Např. Antibiotiková rezistence (ampicilin, tetracyklin, geneticin) Pozitivní x negativní selekce

Plazmidové vektory Odvozené od přirozených plasmidů (E.c., S.c.) Úprava - přes restrikční místa (polylinker) Replikativní Plazmid se ztrácí (nutný stálý selekční tlak) YAC: = umělé kvasinkové chromozómy centromera, telomery BAC: =umělé bakteriální chromozómy HAC: = lidské umělé chromozómy

Virové vektory Bakteriofág λ DNA: cca kbp Inzerční/substituční vektory Retroviry, Adenoviry savčí linie Kombinované vektory: Kosmidy (in vitro pakážování) Souvislosti: Viry a jejich strategie

Integrativní vektory Homologní rekombinace x Náhodná integrace Výhody: 1.Lze udělat knock-out, knock-in 2.Stabilní genetická modifikace Vektory: PCR fragment (5´ konce primerů homologní s cílem) Integrativní plasmid (pop-in, pop- out) Virové - retroviry Agrobacterium tumefaciens

Kapacita vektorů Omezení: Větší molekuly hůře vstupují do buňky Větší molekuly častěji rekombinují Virová DNA musí mít určitou velikost Virová DNA musí obsahovat aparát pro replikaci viru

3.2 Organizmy Přístupy k různým organizmům se liší (principy jsou stejné) Přehled pro tyto organizmy: Bakterie Kvasinky Rostliny Savci

Bakterie (E. coli) Široké spektrum antibiotik (selekce) Jednobuněčné Klonální reprodukce Haploidní Plazmidové i virové vektory Elektroporace, heat shock, (virová) infekce Odlišnosti od eukaryot (sestřih, posttranslační modifikace) Průmyslové využití: Hormony (insulin, růstový hormon, vakcíny) (Insulin 1978) Enzymy (prací prášky) Produkce metabolických produktů (metabolické inženýrství)

Kvasinky (S. cerevisae) Pracuje se s auxotrofními kmeny (selekce) Jednobuněčné Klonální reprodukce (i neklonální) Haploidní/diploidní (dominantní vs. recesivní efekt) Vysoká frekvence homologní rekombinace Plazmidové vektory, YAC, homologní rekombinace Heat shock + LiAc, elektroporace Odlišnosti od vyšších eukaryot (sestřih, modifikace)

Savci Častý sestřih → cDNA Mnohobuněčné (jednobuněčné - tkáňové kultury) Nemnoží se klonálně - germinální linie Diploidní Nízká frekvence homologní rekombinace Plasmidové vektory, retrovirové vektory (integrace) Lipofekce, mikroinjekce, elektroporace Průmyslové využití: Živočišná výroba Produkce vakcín do mléka Xenotransplantace

Knock-out Transgenní myši Chiméra= mozaikový jedinec Knock-out: nutnost delece obou alel

Tkáňově specifická GM U genů, kde celková delece nebo inzerce je letální Cre rekombináza - rekombinace mezi loxP Tkáňově specifický promotor před Cre rekombinázou

Klonování organizmů Odstranění jádra (oocyty) Jádro ze somatické buňky Dolly

Rostliny Častý sestřih → cDNA Mnohobuněčné (jednobuněčné - tkáňové kultury) Klonální i neklonální reprodukce Diploidní Nelze využít homologní rekombinace Biobalistika, elektroporace, Agrobacterium tumefaciens Průmyslové využití: Produkce hormonů, protilátek (pharming & plantibodies) Zemědělská produkce (dále než u živočichů): Rezistence ke škůdcům (toxiny, inhibitory proteáz) Rezistence k virům Změna obsahu olejů (řepka, slunečnice) Změna obsahu proteinů Další vylepšení vlastností (barva, odolnost vůči stresu)

Agrobacterium tumefaciens Vektor pro transformaci rostlin Mechanizmus akce A. tumefaciens: Ti plasmid - integrace Tumorogenní (fytohormony) Exprese enzymů syntézy nopalinu A. tumefaciens se krmí nopalinem VIDEO

Agrobacterium tumefaciens II T-DNA (část Ti plasmidu) - integrace do genomu (náhodná), repetice Úprava T - DNA: integrace požadovaného úseku Modrá růže 2004 VIDEO

3.3 Molekulárně biologické studie 1.Analýza promotorových sekvencí 2.Studie vlivu genu na fenotyp 3.Genomové knihovny 4.Sekvenace organizmů Studium genu/proteinu

Analýza promotorových sekvencí Vložení promotorové sekvence do vektoru před reportérový gen Reportérové geny: Luciferáza GFP

Inaktivace genu - vliv na fenotyp Řízená delece genu - homologní rekombinace (kvasinky, savci) Náhodná inzerce transpozómu - rostliny, Drosophila Kolekce organizmů s delecí (nebo přerušením) různých genů Over-exprese genu Gen pod silným promotorem Indukovatelný promotor (např. stres, nutrient) Efekt genové dóze

Interakce protein-protein Dvouhybridový systém (ve kvasinkách): Fúzní proteiny Protein X s DNA vazebnou doménou RNA pol. Protein Y s aktivační doménou RNA pol. Reportérový gen FRET - fluorescenční proteiny Souvislosti: Fluorescenční proteiny VIDEO

Genomové knihovny 1.Genomové knihovny: Štěpení chromozomální DNA (restrikční enzymy) Ligace fragmentů do vektorů (plazmidy, fágy) Stejnoměrné zastoupení úseků DNA 2. cDNA knihovny: Reverzní transkripce Ligace produktů do vektorů Zastoupení cDNA podle síly exprese Expresní knihovny (1 klon = 1 mRNA) Použití: Hledání proteinových interakcí Hledání receptorových proteinů Komplementace mutace Sekvenace VIDEO

Genomové knihovny II

GK III 1. Vytvoření knihovny 2. Hledání genů

Sekvenování DNA Zjišťování primární struktury DNA Založené na syntéze DNA in vitro (primer) Fragment musí být obklopen známou sekvencí Nejlépe M13 vektory + zaklonovaný fragment Dideoxy metoda + Automatizace

Dideoxy metoda In vitro syntéza DNA Inkorporace dideoxynukleotidu blokuje další polymeraci 1.templátová ssDNA 2.primer (cca 20bp) 3.DNA polymeráza 4.dNTPs +ddCTP ELFA: Polyakrylamidový gel Opakovat pro: ddATP, ddGTP, ddTTP

Automatizovaná sekvenace Vše v jedné reakci – značené ddNTPs

Genome projects Postup: Vytvoření genomové knihovny Automatická sekvenace Počítačová analýza (překryvy) Predikce genů, anotace genů atd. Základní princip: Částečné štěpení (překryvy!) 2 strategie: Shotgun (zcela náhodná sekvenace) Chromosome walking - hledání překryvů HUGO (2001) – 3 mld. USD (1$ na 1 bp)

Shotgun metoda Sekvenace velkého počtu klonů Náhodný výběr klonů

*Chromosome walking Mapování chromozómů Výběr klonů pomocí hybridizace Levnější ale zdlouhavější než shotgun

3.4 Genová terapie Použití genového inženýrství v medicíně: 1.Užívání rekombinantních proteinů (vakcíny, hormony, protilátky) 2. Genová terapie (genetická modifikace buněk pacienta)

Základní typy genové terapie Metodické rozdělení: 1.Ex vivo terapie (odebrání buněk, transformace, návrat buněk) 2.In vivo terapie (transformace v těle pacienta) ad 1.hematopoetická tkáň kožní buňky ad 2.zbylé tkáně zavedení vektoru Rozdělení podle dopadu: 1.Somatická genová terapie (dopad na pacienta) 2.Germinální genová terapie (dopad na potomky) - zatím není

Základní přístupy genové terapie 1.Exprese genu (dominantní efekt) 2.Zabití cílových buněk (nádory) 3.Asistované zabití (nádory) 4.Inhibice exprese 5.Korekce

Aspekty genové terapie Integrace do genomu: výhoda - buňky se dělí nevýhoda - náhodná integrace (tiché místo, aktivace onkogenu) homologní rekombinace - velmi málo účinná (zvláště in vivo) Neintegrativní vektory (volné): Při zabíjení buněk Dočasný efekt Výhody ex vivo metody: Selekce + amplifikace (+ dodatečná selekce, ověření) Častý cíl = kmenové buňky tkáně

Metody genové terapie Retrovirové vektory (8 kbp) pakážovací systémy Adenovirové vektory (DNA virus, 30 kbp) vysoké titry virů, neintegrují se, imunitní reakce AAV Integrace preferenčně na známé místo Liposomy (neomezená velikost) DNA uzavřená v membráně, nízká účinnost, bezpečný Receptorem zprostředkovaná endocytóza Navázání na receptor, selektivita, malá stabilita v těle

Inaktivace genu Jednodušší je zajistit než blokovat expresi genu Někdy lze inaktivovat gen pomocí exprese jiného genu: aptamery, ribozymy, mutantní proteiny, intrabodies TFO - triplex forming oligonucleotide aptamer - vazebný oligonukleotid ribozymy - s RNázovou aktivitou

Nemoci léčené genovou terapií 1. Dědičná onemocnění (recesivní onemocnění) Poprvé 1990 Převážně ex vivo 2. Nádorová onemocnění Často pouze in vivo Zabití buněk nebo vyvolání imunologické reakce 3. Infekční onemocnění Blok reprodukce viru - např. HIV (vstup do buněk, replikace)

Shrnutí Genové inženýrství = cílený zásah do genetické informace organizmu Vektor = plazmid, virus nebo integrativní fragment DNA Selekce pozitivních klonů Použití = zemědělství, medicína, průmysl, základní výzkum Specifické zacházení s jednotlivými organizmy Jednobuněčné x mnohobuněčné; haploidní x diploidní Genomová knihovna je kolekce klonů nesoucích části DNA cDNA knihovna je kolekce klonů nesoucích cDNA Sekvenační projekty kombinují in vitro techniky a knihovny Genová terapie: dědičná onemocnění, nádory i infekce Exprese genu (dominantní efekt) x inaktivace genu