DIGITÁLNÍ UČEBNÍ MATERIÁL Číslo projektuCZ.1.07/1.5.00/ Název projektuZlepšení podmínek pro vzdělávání na MGO Název školyMatiční gymnázium Ostrava,Dr. Šmerala 25/2565, , Ostrava Název materiáluReplikace DNA AutorRNDr. Mgr. Tomáš Adamus, Ph.D. Tematický okruhBiologie člověka a genetika Ročník3. a 4. ročník (septima, oktáva) Vytvořeno AnotaceCílem je zopakovat a procvičit problematiku replikace DNA. Metodický pokyn Předložený materiál se zabývá problematikou replikace DNA. Lze jej využít k podpoření výchovně vzdělávacího procesu v biologii i chemii, nejčastěji v předposledním a posledním ročníku gymnaziálního vzdělávání. Pokud není uvedeno jinak, použitý materiál je z vlastních zdrojů autora.

Replikace DNA Vede ke vzniku dvou dceřinných molekul DNA, které vznikly z jedné mateřské molekuly DNA  zdvojnásobení = zdvojení genetické informace. První poznatky o replikaci získány studiem u prokaryot - genetická výbava je podstatně jednodušší - v prokaryotech je přítomna v buňce vždy jen jedna molekula DNA (např. u bakterií zvaná jako bakteriální chromozom). U eukaryot probíhá v S – fázi buněčného cyklu.

S fáze je pojmenována a označena podle syntézy, tedy syntetické fáze a vyžaduje dodání ATP  je energeticky náročná. Poznatky o replikaci DNA eukaryot se většinou odvozují z experimentálních prací prováděných s polyténními chromozómy zástupců dvoukřídlého hmyzu. Tyto „gigantické chromozomy“ jsou přítomny například ve slinných žlázách drozofily = octomilky (nejlépe se získávají z larev). Vznikají opakovanou replikací DNA bez následného rozdělení chromozomů.

Polyténní chromozomy lze nalézt ve slinných žlázách hmyzu (nejčastěji dvoukřídlí). Proč se nacházejí právě tam?

Vznikají zde proto, že díky jejich existenci dojde ke zvýšení počtu kopií genů na nich se nacházejících, což urychlí proces transkripce a translace a tím pádem se také zvýší produkce slin slinnými žlázami. Dále byly pozorovány u protist, rostlin a savců. Zdroj:

Obr.octomilka obecná (Drosophila melanogaster) Zdroj:

často využívaná v genetických výzkumech náleží ke klíčovým modelovým organizmům vývojové biologie. celý rod zahrnuje přibližně druhů lidově nazývá banánová muška nebo octová či ovocná muška  charakteristický výskyt mnoha druhů na přezrálém nebo hnijícím ovoci. ? Proč je octomilka klíčovým modelovým organizmem v genetice?

oMá krátkou generační dobu (o 2 týdnech) a vysokou plodnost (samičky mohou naklást 500 vajíček v 10 dnech). oMá jen 4 páry chromozómů: 3 páry autozomů a 1 pár pohlavních chromozomů, snadno s etak může pozorovat dědičnost sledovaných znaků. oJejí genom byl sekvenován v roce 1998 (určeno tak bylo pořadí nukleotidů, jež její genom tvoří).

Replikace probíhá semikonzervativním způsobem – vzniklá DNA sestává ze dvou komplementárních polynukleotidových řetězců – jednoho původního a jednoho nově nasyntetizovaného (dceřinného). původního řetězce. V dceřiných molekulách DNA zůstává zachováno původní pořadí nukleotidových párů, tedy vlastní genetická informace. Princip publikovali Watson, Crick (1953), experimentálně pak prokázali na bakterii E. coli Meselson a Stahl (1958)

proces principiálně stejný pro prokaryota i eukaryota. U prokaryot se hovoří o theta replikaci – replikujicí se DNA připomíná písmeno řecké abecedy theta. pro eukaryota je replikace složitější – zásadní rozdíl - větší počet replikačních počátků – DNA velkých eukaryotických chromozomů jich obsahuje stovky až tisíce.

nový řetězec narůstá ve směru 5´ 3´. Replikace je zpravidla dvousměrná – od místa zahájení replikace = replikační počátek - se na obě strany molekuly vytvářejí tzv. replikační vidlice. Postupně se tak tvoří replikační oko. Vše jsou „struktury“ dočasné, časově vázané na dobu replikace.

Hlavní enzym replikace = DNA polymeráza hlavní úkol - katalýza vzniku fosfodiesterové vazby mezi 5´ koncem volného nukleotidu a 3´ koncem rostoucího řetězce  výše uvedený směr replikace. DNA polymeráz je vícero typů. U prokaryot DNA-polymeráza I, II, III. DNA-polymeráza I -reparační funkce a koriguje správné párování bází, syntetizuje DNA, vyštěpuje krátké sekvence RNA (primery), DNA-polymeráza III syntetizuje novou DNA, koriguje správnost párování bází.

U eukaryot DNA-polymeráza  a , mají také opravnou funkci = korektura (proofreading) - DNA polymeráza zkontroluje před připojením dalšího nukleotidu předcházející nukleotid. Pokud se správné párování s templátem, pak připojí další nukleotid. Pokud chyba a párování není správné, sama odstraní špatný nukleotid rozštěpením fosfodiesterové vazby a přidá správný nukleotid  2 funkce (v daném směru): – 5´ 3´ polymerační – 3´ 5´ nukleázovou aktivitu (štěpí nukleové kyseliny)

DNA-polymeráza připojuje nukleotidy pouze k již existujícímu polynukleotidovému řetězci, tzn. primeru, který musí být předtím nasyntetizován. Primer = komplementární krátký úsek RNA, syntetizovaný působením enzymu primázy.

Základní fáze replikace Replikace sestává ze 3 na sebe navazujících fází, kterými jsou: – iniciace, – elongace, – terminace.

Iniciace: iniciace – zahájení replikace v replikačním počátku (v bodě zvaném ORI, ORIGIN – speciální sekvence nukleotidů), na který se váže iniciační protein, který iniciuje rozvíjení dvoušroubovice za účasti rozvíjecích proteinů tzv. rozmotávacích bílkovin - např.: – topoizomeráza – rozvolňuje nadšroubovicové struktury, – helikáza (helix) – uvolňuje dvouvlákno, – SSB proteiny (single strand binding) – udržují úsek vlákna v lineární podobě.

Nejdříve je nasyntetizován krátký primer (RNA primer) - oligonukleotidý řetězec (primerová RNA), který vzniká za katalýzy DNA dependentní RNA polymerázy = DNA primázy (zjednodušeně RNA polymeráza). Počáteční bod ORI je identifikován RNA- polymerázou a syntéza RNA probíhá podle matrice = předlohy DNA až k místu, kde dojde k jejímu zastavení. RNA-polymeráza se pak od jednovláknité DNA (ssDNA) v místě replikačního oka uvolní a na vytvořený RNA primer se navazují za účasti DNA-polymerázy III (u eukaryot polymeráza  ) jednotlivé deoxyribonukleotidy nově syntetizovaného dceřiného řetězce DNA.

Počet replikačních míst, kde se zahajuje replikace DNA téhož chromozómu, záleží na vývojovém stádiu organizmu (  proliferační aktivitě buněk): – v jádrech embryonálních buněk Drosophily, které se replikují velmi rychle (asi 1x za 9,5 min.) začíná replikace na až replikačních místech. – v buňkách imaga Drosophily se na chromozomální DNA otvírá daleko méně replikačních ok a rychlost replikace je tak výrazně opožděna.

Elongace: elongace – replikace na obou vláknech (řetězcích) neběží stejně (když ty jsou antiparalelní = protistojné) – rozlišujeme: – vedoucí řetězec - syntetizovaný řetězec klasicky připojováním nukleotidů, – zpožďující se řetězec (váznoucí řetězec) – diskontinuální syntetizování přes Okazakiho fragmenty (opět ve směru 5´ 3´). Okazakiho fragmenty sestávají u prokaryot z 1000 – 2000 nukleotidů, u eukaryot z 100 – 200. Okazakiho fragmenty jsou spojovány DNA ligázou.

Terminace: Terminace – zakončení replikace Prokaryota - cirkulárního chromozom - 3´ konec posledního nukleotidu vedoucího řetězce se naváže na 5´ konec opožďujícího řetězce. Tak dojde k uzavření kruhovité molekuly a replikace je ukončena. Eukaryota – lineární řetězce DNA  celá replikace včetně terminace je značně komplikovanější.

Primeru je potřeba nejen pro start replikace DNA na vedoucím řetězci, ale též v každém Okazakiho fragmentu. Odstranění primeru z řetězce DNA zajišťuje exonukleáza (DNA polymeráza I). Nově vzniklá dvouvláknová DNA se svinuje do šroubovice „svíracím proteinem“, který je jednou z podjednotek DNA–polymerázy III.

Po odstranění primeru exonukleázou zůstává tento konec molekuly kratší. Opakováním replikačních cyklů se chromozom, jehož součástí inkriminovaná DNA je, zkracuje. Tomu do jisté míry zabraňují opakující se sekvence = repetice nukleotidů na koncích eukaryotických chromozomů, zvané telomery. Zkrácení telomer nevede ke zredukování počtu strukturálních genů. Objeveno také příležitostné opětovné prodlužování telomer, a to v důsledku činnosti enzymu telomerázy.

Zkrátí-li se pod určitou mez, pak buňka zahyne. Takový způsob zániku buňky lze klasifikovat jako apoptózu - programovanou smrt buňky – zde je „naprogramováno“ zkracování telomer. ve většině normálních buněk telomeráza není. Přítomna je však v buňkách nádorových, jejichž telomery se tak nezkracují a buňky nemohou přirozeně zahynout. Proto je průkaz telomerázy v buňce důkazem, že se jedná o buňku nádorovou.

Obr. Schéma replikace Zdroj:

Obr. Schéma replikace Zdroj:

Odkazy na animace replikace DNA ature=relmfu ature=relmfu

Zdroje: Nečas, O. et al. Obecná biologie pro lékařské fakulty. Nakladatelství H  H, 2003, ISBN Malachová, K., Pečinka, P.: Obecná biologie. Učební texty Ostravské Univerzity McMurry, J.: Organická chemie. VUT Brno, VŠCHT Praha, 2007 Romanovský, A. a kol.: Obecná biologie. SPN Praha 1985 Rosypal, S. et al.: Nový přehled biologie. Scientia, Praha, 2003

Rosypal, S. et al.: Přehled biologie. Scientia spol. s r.o. pedagogické nakladatelství Praha, 1994 Dobiáš, L. Repetitorium z buněčné a molekulární biologie. Multex Soft Ostrava, 2003 MADPRIME. DNA replication. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, [cit ]. Dostupné z: _split.svg _split.svg

Replikace DNA. In: Wikipedia: the free encyclopedia [online]. San Francisco (CA): Wikimedia Foundation, [cit ]. Dostupné z: nogaster_-_side_(aka).jpg nogaster_-_side_(aka).jpg ry/image162.jpg ry/image162.jpg