BIOFILM Lékařská mikrobiologie – cvičení, jarní semestr 2016 Mikrobiologický ústav LF MU

Osnova  Co je biofilm?  Vznik biofilmu  Druhové zastoupení biofilmu  Diagnostické metody pro detekci biofilmu

Co je biofilm?  Biofilm je organizované společenství mikroorganismů tvořící se na rozhraní fází (nejběžněji na rozhraní pevné / kapalné prostředí).  Jeden z klíčových virulenčních faktorů.  Organismy žijící ve formě biofilmu vykazují odlišné vlastnosti od planktonně žijících organismů (odlišná rychlost růstu, transkripce odlišných genů,...).  Výskyt: medicína, vodárenský průmysl, potravinářství, příroda,...

Proč žít ve formě biofilmu?  Z takto vzniklého společenství plynou mikroorganismům mnohé výhody:  Ochrana před chemickými látkami  Mechanická ochrana  Vliv na účinek ATB  Výměna genetické informace (rezistence)  Kooperace mezi jednotlivými druhy  Vytvoření „biofilmové homeostázy“  Ochrana před účinkem imunitního systému

Biofilm v průmyslu

Biofilm v medicíně

Vznik biofilmu (1)  Adheze na povrch:  adsorpce organických molekul na povrch nosiče  adsorpce mikrobů na povrch – reverzibilní  ireverzibilní. Tohoto procesu se účastní fyzikální van der Waalovy síly, hydrofobní a elektrostatické interakce, dále nespecifické chemické vazby (vodíkové můstky, polární a kovalentní vazby) a specifické interakce (účast adhezinů, fimbrie, pili, bičíky). Primární kolonizátor se množí na povrchu  vznik mikrokolonií. o Primární kolonizátor se množí na povrchu  vznik mikrokolonií. o Nasedání dalších buněk stejného i odlišného druhu – fáze akumulace a agregace biofilmu. Opět princip adheze.

Vznik biofilmu (2)  Tvorba exopolysacharidů a dozrávání biofilmu  Exopolysacharidy vyplňují prostor mezi jednotlivýmu buňkami biofilmu – závisí na okolních fyzikálních i chemických podmínkách  Uvolnění buněk zralého biofilmu, šíření dále do těla – možno jak chemicky, fyzikálně, tak enzymaticky (quorum sensing)

Vznik biofilmu (3)  1) reverzibilní adheze  2) ireverzibilní adheze  3) tvorba mikrokolonií, koadheze  4) zrání biofilmu  5) disperze, šíření biofilmu

Vznik biofilmu (4)  Doba trvání jednotlivých fází

Složení biofilmu  Biofilm může být jednodruhový či vícedruhový.  Obsahuje buňky jednotlivých zástupců biofilmu a extracelulární matrix vyplňující prostor mezi buňkami.  Extracelulární matrix obsahuje:  Voda (až 97 %)  (Mikrobiální buňky (2-5 %) )  Polysacharidy (1-2 %)  Proteiny (< 1-2%) – výsledek lyze, enzymy  DNA a RNA (< 1-2%) – z lyzovaných buněk  Ionty – vázané i volné

Regulace biofilmu – Quorum sensing  Detekce okolních buněk, jejich polohy a množství pomocí systému „quorum sensing“ pomocí chemických signálů (nejčastěji laktony, oligopeptidy,...).  Účelové chování buňky – produkce signálních molekul a jejich kumulace  při překročení prahové koncentrace dojde ke změně exprese geů (signální molekula se naváže na membránový receptor na povrchu buňky).  Buňky takto mohou reagovat na stres, hustotu populace, pH, množství živin v okolí,...

Biofilm jako faktor virulence  Velice významný faktor – ochrana mechanická, chemická, před imunitním systémem, vliv na účinek ATB, výměna genetické informace mezi členy společenstva.  Biofilm má podíl především na chronických infekcích (do souvislosti s přítomností biofilmu se dává až 80 % všech infekcí!).  Častý výskyt u pacientů s plicními infekcemi (cystická fibróza, intubovaní pacienti), s močovými infekcemi (katetrizovaní pacienti).

Antimikrobiální rezistence biofilmu (1)  Mikroorganismy ve formě biofilmu tolerují až 100 – 1000x větší dávky antimikrobiálních látek než planktonně žijící.  Proč?  Extracelulární matrix snižuje difúzi léčiva – mechanická bariéra  Povrchový náboj – náboj matrix ztěžuje vstup polárních a nabitých ATB + vychytávání ATB)  Gradienty v biofilmu – různé vrstvy biofilmu mají různé prostředí (např. některá ATB nepůsobí v anaerobním prostředí, ale pouze na okraji biofilmu)

Antimikrobiální rezistence biofilmu (2)  Mikroorganismy ve formě biofilmu tolerují až 100 – 1000x větší dávky antimikrobiálních látek než planktonně žijící.  Proč?  Většina ATB lépe působí na rostoucí buňky  pomale rostoucí spodní vrstvy tak rychleji začnou ATB tolerovat  Výměna genetické informace mezi jednotlivými zástupci (možný vznik rezistentních mutant)  Horizontální přenos genů  Perzistující varianty mikroorganismů – zodpovědné za relapsy onemocnění

Eradikace biofilmu  Velice obtížná.  Antimikrobiální léčba většinou potlačí pouze symptomy, tedy infekce způsobené planktonními buňkami uvolněnými z matrix biofilmu  buňky ve formě biofilmu většinou nejsou zasaženy.  Je nutno použít velmi vysokých koncentrací antimikrobiální látky, ideálně v kombinaci.  Pokud léčba stále selhává (což se většinou bohužel děje)  vyjmout ložisko biofilmu (implantát, katétr,...).  Nové možnosti – např. enzymoterapie.

Prevence vzniku biofilmu  Vhodná volba impantátu a materiálu, z nějž je implantát vytvořen (nová generace plastů, impregnace koloidním stříbrem, antimikrobiálními látkami).  Proškolený personál dodržující pravidla asepse a dekontaminace.  Preventivní podání ATB u ohrožených pacientů.

Diagnostika biofilmu (1)  Průkaz biofilmu:  Fenotypové metody (Christensenova metoda, kultivace na agaru s kongo červení)  Kvantifikace vrstvy biofilmu (zjištění počtu CFU po předchozí sonikaci, obarvení a spektrofotometrie, kolimetrie – resazurin, konfokální mikroskopie,...)  Genotypové metody (PCR)

Diagnostika biofilmu (2)  Minimální inhibiční koncentrace (MIC) platná pro planktonní buňky neodpovídá koncentracím schopným zasáhnout biofilm.   MBIC – minimální biofilm inhibující koncentrace.  MBEC – minimální biofilm eradikující koncentrace.  Hodnoty MBEC leží často nad break pointem pro daná ATB.  Rozdíly v citlivosti MBEC vs. MIC jsou až několik řádů.

Rozdíly v citlivosti MIC, MBIC, MBEC

Orální biofilm

Úkol 1: Mikroskopie orálního biofilmu

Úkol 2:Vliv čištění zubů na orální biofilm  Po obarvení biofilmu jodovým roztokem (cca 2 min)  Zapište, kde se nachází nejvíce biofilmu

Úkol 3: Průkaz mikrobů kolonizujících katétry (1)  Kvalitativní pomnožení v bujonu: citlivé, ale nelze rozlišit kolonizaci od kontaminace  metoda se nedoporučuje. Negativní výsledek vylučuje kontaminaci.  Semikvantitativní metoda (Makiho metoda): katétr je válen po povrchu agaru sterilní pinzetou –  Pro krátce zavedené katétry  vnější kolonizace  Pro déle zavedené katétry  nevhodné, kolonizace je především zevnitř  Kolonizace při >15 koloniích Sonifikační metoda: katétry sonifikovány v ultrazvukové vaně, uvolněné bakterie jsou následně kvantifikovány vyočkováním na krevní agar  zjišťuje se počet CFU. Hranice pozitivity: > 100 (1000) CFU

Úkol 3: Průkaz mikrobů kolonizujících katétry (2)  Porovnejte jednotlivé metody a rozhodněte o možné kolonizaci katétru.  kvalitativní metoda  semikvantitativní metoda ( >15 CFU)  sonifikace katetru (>100 CFU)

Úkol 4: Vliv přítomnosti sacharidů na dynamiku růstu biofilmu  Vyplňte přibližný průměr hodnot absorbance do tabulky a sestrojte prostorový graf; učiňte závěr o množství přidané glukózy a růstu biofilmu S. mutans.

Úkol 5: Citlivost biofilmpozitivních mikrobů k ATB  zákal/žluté důlky znamenají růst mikrobů  odečtěte hodnoty MIC (planktonická forma) a MBEC (biofilm)  porovnejte hodnoty mezi sebou

Úkol 6: Citlivost biofilmpozitivních mikrobů k fágovému preparátu (1)  Nutné najít alternativní způsoby terapie. Jednou z možností je léčba pomocí bakteriofágů  plaková metoda (metoda dvouvrstevného agaru).  Postup:  rozvařte (cca 15 min.) 2,5 ml 0,7% masopeptonového agaru (MPA) a temperujte na 42 °C  vytvořte suspenzi Staphylococcus aureus v 0,7% MPA  suspenzí přelijte misku s 1,5% MPA a nechte ztuhnout na Petriho misku kápněte 10–20 μ l fágového preparátu STAFAL  odečtěte předpřipravený výsledek testu (váš test by se nyní inkuboval)

Úkol 6: Citlivost biofilmpozitivních mikrobů k fágovému preparátu (2)

Úkol 6: Citlivost biofilmpozitivních mikrobů k fágovému preparátu (3)

Po tomto cvičení byste měli:  Vědět, co je biofilm a kde se s ním můžete setkat.  Znát vznik biofilmu.  Umět popsat obtíže a terapii infekce způsobené biofilmovými společenstvi.