STANOVENÍ SEKUNDÁRNÍCH ROSTLINNÝCH METABOLITŮ ELEKTROCHEMICKOU DETEKCÍ Pavel Hanuštiak

OBSAH PŘEDNÁŠKY Úvod Cíle práce Teoretická část Flavonoidy Elektrochemické metody Chromatografické metody Experimentální část Stacionární detekční systém Průtokový detekční systém Závěr

Úvod Flavonoidy jsou důležité sekundární rostlinné metabolity. Jako takové se nacházejí v potravinách, jsou tedy nedílnou součástí diety. Jejich význam je rozsáhlý. Současný stav studia stanovení flavonoidů je založený na velmi drahých a časově náročných metodách. Elektrochemické metody jsou jednoduché a relativně levné, selektivní a časově dostupné. Pro analýzu pomocí HPLC lze využít i elektrochemické detektory, které skrývají výhody jak elektrochemických, tak chromatografických metod.

Cíle práce  Stanovení vybraných flavonoidů na stacionárním detekčním systému  Optimalizace průtokové elektrochemické analýzy na chromatografickou separaci flavonoidů

TEORETICKÁ ČÁST Elektrochemické metody Sekundární rostlinné metabolity Chromatografické metody

Sekundární rostlinné metabolity organické látky, které se většinou nezapojují přímo do procesu vývoje a růstu rostlinné sekundární metabolity dělíme do tří hlavních skupin: terpeny, alkaloidy a fenylpropanoidy a jim příbuzné fenolické sloučeniny Fenolické sloučeniny přes sloučenin odvozeny šikimátovou nebo malonát-acetátovou cestou většina odvozena od fenylpropanoidové nebo fenylpropanoid-acetátové cesty FLAVONOIDY – jedna z nejvýznamnějších skupin fenolických sloučenin

Sekundární rostlinné metabolity Flavonoidy velice rozsáhlá skupina rostlinných fenolů známo více jak těchto látek, stále se nacházejí další odvozeny od heterocyklické sloučeniny flavanu, jednotlivé flavonoidy se od sebe liší stupněm oxidace a substituce přírodní se vyskytují většinou ve formě O-glykosidů, volné aglykony se vyskytují většinou zřídka při technologickém zpracování (vliv teploty a kyselého prostředí) může docházet ke zvýšené koncentraci aglykonů 5/5/ 4/4/ /1/ 6/6/ 3/3/ 2/2/

Sekundární rostlinné metabolity Flavonoidy Význam flavonoidů Protisrážlivé působení Antiestrogenní účinek Protizánětlivé působení Antimikrobní aktivita Spasmolytický účinek Antioxidační aktivita zhášení O. ochrana LDL frakcí (Anti)karcinogenní účinek ?

Elektrochemické metody Elektrochemickými metodami lze rychle a citlivě stanovit anorganické a organické látky ve složité biologické matrici. Jejich podstatou je studium závislosti elektrochemického chování roztoků na jejich složení a koncentraci Metody, při nichž článkem neprochází elektrický proud rovnovážná potenciometrie Metody, při nichž elektrický proud článkem prochází polarografie ampérometrie voltametrie Metody založené na kvantitativní přeměně analytu elektrogravimetrie coulometrie Metody založené na měření určité elektrické vlastnosti roztoku jako celku konduktometrie dk-metrie Rozdělení elektrochemických metod

Elektrochemické metody Metody pro stanovení biologicky aktivních látek Cyklická voltametrie Diferenční pulzní voltametrie Potenciometrická rozpouštěcí analýza Voltametrie s pravoúhlým střídavým napětím (square wave voltammetry SWV) Square wave voltammetry vyvinula se aplikací SW polarografie na stacionární elektrody podstata tkví v tom, že na stupňovitě měnící se potenciálovou rampu se přikládá pravoúhlé střídavé napětí a volitelnou amplitudou a frekvencí od jiných technik se liší především větší rychlostí při zachování citlivosti

Elektrochemické metody Pracovní elektrody Rtuťové elektrody Kapající rtuťová elektroda Visící rtuťová elektroda Pevné elektrody Kovové elektrody Uhlíkové elektrody ze skelného uhlíku, z pyrolytického grafitu, voskové elekrody, parfinem impregnovaná grafitová elektroda, z uhlíkových vláken, UHLÍKOVÁ PASTOVÁ ELEKTRODA

Elektrochemické metody uhlíková pasta:zvláštní typ elektrodového materiálu připravuje se smíšením uhlíkového prášku a vhodného pojiva (el. nevodivá organická kapalina) tato pasta se vpraví do teflonového těla elektrody např. pístového typu dostatečná fixace pasty vodivé spojení obvodem snadná příprava pracovního povrchu elektrody

Chromatografické metody Princip chromatografie Chromatografie je separační metoda, tedy metoda, při které se oddělují - separují složky obsažené ve vzorku. Svým určením je to především metoda kvalitativní a kvantitativní analýzy vzorku. Rozdělení chromatografických metod Podle skupenství mobilní fáze Kapalinová chrmomatografie Plynová chromatografie Podle uspořádání stacionární fáze Kolonová chromatografie Plošné techniky Podle povahy převládajícího děje při separaci Rozdělovací chromatografie Adsorbční chromatografie Iontově-výměnná chromatografie Gelová cgromatografie Afinitní chromatografie

Chromatografické metody Kapalinová chromatografie mobilní fází je kapalina mobilní i stacionární fáze se výrazně podílejí na separaci analytu čas, strávený v jedné či druhé fázi, závisí na afinitě ke každé z nich podle uspořádání stacionární fáze rozlišujeme kolonovou chromatografii a papírovou či tenkovrstvou kapalinovou chromatografii

Chromatografické metody Vysoce účinná kapalinová chromatografie V principu metoda shodná s klasickou kolonovou chromatografií. Stacionární fáze je umístěna v koloně a separovaná látka je přes ni unášena (za vysokého tlaku) fází mobilní. Při nástřiku dvojice látek do chromatografické kolony se nejprve vytvoří eluční pás obsahující směs obou látek. Ty jsou potom unášeny mobilní fází a na náplni kolony dochází k jejich separaci. Po výstupu první látky z kolony indikuje její přítomnost v eluátu a zaznamená na eluční pík (křivku). Jakmile obě rozdělené látky vyjdou, jsou zapisovačem zaznamenány jako dva eluční píky.

Chromatografické metody Detekční systémy v kapalinové chromatografii Detektory by měly být selektivní a málo citlivé na mobilní fázi. Fotometrické detektory Refraktometrický detektor Fluorescenční detektor Hmotnostní spektometr Elektrochemické detektory

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Průtokový systém stanovení flavonoidů Stacionární systém stanovení flavonoidů

Elektrochemické stanovení vybraných flavonoidů elektroanalytické stanovení vybraných flavonoidů: rutinu, quercetinu, quercitrinu, diosminu a chrysinu metodu použít pro stanovení flavonoidů v biologickém materiálu Cíle

Analyzátor AUTOLAB (EcoChemie) v zapojení s tříelektrodovou celou VA – Stand 663 (Metrohm), square–wave voltametrie pracovní pastová uhlíková elektroda, referenční Ag/AgCl (3 M KCl) elektroda, pomocná elektroda uhlíková tyčka poteciálový krok: 1,95 mV; pulzní amplituda 49,85 mV; pufr fosfátový; pH = 7,0 Elektrochemické stanovení vybraných flavonoidů 500 nA 00,51,0 elektrolyt Quercetin pík 1 pík 2 pík 3 00,51,0 Potenciál / V 50 mA Quercitrin pík 1 pík 2 pík 3 0 0,5 1,0 Potenciál / V 50 mA Rutin pík 1 pík 2 0,250,51,0 5 mA Chrysin pík 2 pík 4 0,75 0,25 0,5 1,0 Potenciál / V 5 mA Diosmin pík 2 pík 3 pík 4 0,75

Elektrochemické stanovení vybraných flavonoidů Optimalizace parametrů metody Quercetin Rutin Quercitrin Chrysin Diosmin Britton-Robinson Fosfátový pufr Borátový pufr Acetátový pufr Quercetin Rutin Quercitrin Chrysin Diosmin [%] potenciálový krok (mV) Potenciál (V) Frekvence (Hz) Potenciál (V) [%]

Elektrochemické stanovení vybraných flavonoidů Shrnutí frekvence f = 180 Hz potenciálový krok = 1,95 mV fosfátový pufr pH = 7,0 Limity detekce (3 S/N) 2663Diosmin 56Chrysin 0,85Rutin 0,73Quercitrin 1,04Quercetin LOD (nM) Flavonoidní látky

Elektrochemické stanovení vybraných flavonoidů Stanovení v biologické matrici Potenciál (mV) nA Chrysin 2  A Diosmin Potenciál (mV) 10  A Rutin 5.0  A Quercitrin Potenciál (mV)  A Quercetin Potenciál (mV) 200 a b c d e a b c d e 100 a b c d e Potenciál (mV) 100 a b c d e a b c d e a) elektrolyt; b) lidská moč 1/1000; c) koncentrace 5 mM (diosmin 300 mM); d) 7.5 mM (400 mM); e) 10 mM a disomin 500 mM

Elektrochemické stanovení vybraných flavonoidů Stanovení v biologické matrici 0,150,25 0,35 Potenciál (mV) 1 nA SPARTAN 1 nA 0,15 0,250,35 Potenciál (mV) ŠAMPION GOLDEN 0,15 0,250,35 Potenciál (mV) 1 nA RUBÍN 1 nA 0,15 0,25 0,35 Potenciál (mV) 5 ul vzorku elektrolyt 10 ul vzorku 15 ul vzorku 20 ul vzorku 25 ul vzorku 30 ul vzorku 35 ul vzorku 40 ul vzorku 45 ul vzorku 50 ul vzorku quercitrin 92 ± 3 mg/kg

Chromatografické stanovení vybraných flavonoidů

Děkuji za pozornost