Regulace transkripce u prokaryot Regulace transkripce u prokaryot - kapitola 16 Restrikční enzymy - kapitola 5 Molekulární klonování – kapitola 4 a 5

Proč je nutné kontrolovat expresi genů? Buňka potřebuje vyrábět různé proteiny v závislosti na buněčném cyklu, prostředí atd. Buňka produkuje různé produkty Např. lidský organismus obsahuje 200 typů buněk, celkem 37.2 trillionů buněk, všechny maji stejnou genetickou výbavu, přesto dělají různé věci

Efektivní vs. rychlá regulace Efektivní regulace je na úrovni transkriptu – Vyžaduje méně energie Rychlá regulace je na úrovni proteinu – Protein je vždy připraven plnit svou funkci

Regulace exprese genů E.coli – Ze 4000 genů je exprimováno v každý okamžik alespoň 1000 – Dle podmínek, geny jsou zapnuty a vypnuty – Změna teploty  změna exprese genů

Proteiny regulující genovou expresi Jak najdeme proteiny, které regulují genovou expresi? – Je nutné najít mutanty pro Strukturní proteiny, jenž vykonávají svou funkci Regulační proteinu, které kontrolují aktivitu strukturních genů Regulační elementy, jenž fungují v cis a trans pozici Genetická analýza baktérií v 50. letech 20. století identifikovala první proteiny regulující genovou expresi (transkripční faktory) Francois Jacob, Jacques Monod, Andre Lwoff – Nobelova cena v roce 1965 Příklady – lac operon – lamda ( ) represor

Pozitivní vs. negativní regulace Pozitivní – Gen se nepřepisuje, pokud není aktivován – AKTIVÁTOR Negativní – Exprese genu je pozastavena dokud není represor vyvázán – REPRESOR

Alosterická regulace Aktivátor – transkripční faktor, nutný pro expresi genu Represor – vypíná expresi genu U pozitivní regulace – aktivátor nutný pro zapnutí exprese, obvykle se váže upstream od promotoru U negativní regulace – represor neumožňuje transkripci dokud není vyvázán, obvykle se váže downstream od promotoru Indukční činidlo (inducer/effector) – Obvykle malá signální sloučenina (živina) – váže se na aktivátor/represor a aktivuje jeho funkci

Operon Kluster genů pod jedním promotorem Polycistronická mRNA Francois Jacob and Jaques Monod – poprvé definovali operon – negativně regulovaný laktózový operon

lac operon Zodpovědný za katabolický metabolismus laktózy lac operon – strukturní geny – lacZ – β galaktosidáza – lacY – permeáza laktózy – lacA – acetyláza laktózy (není esenciální) lacI – represor – upstream of lacAYZ – Transkripce probíhá v opačném směru lacO - operátor

lac operon – transkripce je OFF Při absenci laktózy v prostředí/médiu

lac operon – transkripce je ON Za přítomnosti laktózy v prostředí/médiu

Genetické experimenty, jenž vedly k charakterizaci regulace lac operonu Francois Jacob a Jaques Monod experimenty odhalily podstatu genové exprese Předpoklady pro studium genové exprese: Detekce mRNA Detekce aktivity proteinu Podmínky, ve kterých hladina exprese se různí (indukce) Možnost diploidního organismu – u baktérií vyřešeno pomocí F‘ plasmidu Mutace, které eliminují aktivitu enzymu budou nejspíše změny ve strukturním genu ( Z - a Y - ) Mutace ovlivňující inducibilitu budou nejspíše mutace ve regulačních oblastech DNA (O c ) a regulačních genech (I -, I S ) Trans-acting Cis-acting

Operátor funguje pouze v pozici cis a tudíž je to místo na DNA, nikoliv protein. Genetické experimenty, jenž vedly k charakterizaci regulace lac operonu KONSTITUTIVNÍ MUTACE O + /O c

Figure 10-9 Represor funguje i v pozici trans – tudíž je to protein, který volně přistupuje k oběma DNA Genetické experimenty, jenž vedly k charakterizaci regulace lac operonu KONSTITUTIVNÍ MUTACE I + /I -

Represor je alostericky regulován přítomností/absencí laktózy Genetické experimenty, jenž vedly k charakterizaci regulace lac operonu Alosterická regulace I + /I S (super-represor)

Globální regulace lac operonu lac operon je ON pokud je v prostředí přítomna laktóza lac operon je OFF pokud je v prostředí přítomna laktóza a glukóza zároveň CAP protein (catabolite activator protein) encoded by the crp gene

cAMP-CAP complex cAMP je signál, že buňka má málo glukózy CAP zapíná geny pro metabolismus maltózy, laktózy a dalších cukrů při absenci glukózy Propojení negativní (lac I) a pozitivní (cAMP-CAP) kontroly exprese genů!!

Shrnutí lac operonu Positivní a negativní regulace najednou

araBAD operon Operon kódující geny, které jsou zodpovědné za katabolický metabolismus arabinózy araC – regulační protein kontrolující transport a metabolism arabinózy araBAD (metabolismum) a araFG (transport, uptake) geny jsou reprimovány AraC při absenci arabinózy, a aktivovány při její přítomnosti

AraC je aktivátorem a represorem zároveň (2 různé konformace) – Aktivátor - když je přítomna arabinóza Pomáhá rozeznat oblast a vazbě na DNA – Represor – když není přítomna arabinóza Brání vazbě RNAP na promotor Brání posunu RNAP vpřed araBAD operon

Negativní represibilní regulace trp operonu Operon pro syntézu tryptofanu – trpEDBCA 2 mechanismy regulace transkripce trp operonu: – Globální kontrola celého operonu (přítomnost/absence tryptofanu) – Doladění exprese (vysoká /nízká hladina tryptofanu)

Negativní represibilní regulace trp operonu

TrpL – leader 160bp – Sekvence 1,2,3,4 – mohou vytvořit vlásenku – Obsahuje velmi vzácné kodóny pro Trp Atenuace – Není to on/off – Translace je vyladěna na přítomnost tryptofanu U prokaryot k translaci může docházet ihned po zahájení transkripce Propojení transkripce a translace za účelem regulace genové exprese Negativní represibilní regulace trp operonu – atenuace transkripce

Negativní represibilní regulace trp operonu - atenuace TrpL – leader 160bp – Sekvence 1,2,3,4 – mohou vytvořit vlásenku – Obsahuje velmi vzácné kodóny pro Trp Atenuace – Není to on/off – Translace je vyladěna na přítomnost tryptofanu U prokaryot k translaci může docházet ihned po zahájení transkripce Propojení transkripce a translace za účelem regulace genové exprese

lamda ( ) represor reguluje přechod mezi lytickým a lysogenním cyklem fága Exprese fágových genů je ON Exprese fágových genů je OFF Exprese fágových genů je ON

lamda ( ) represor reguluje přechod mezi lytickým a lysogenním cyklem fága

Figure Lysogenní vs. lytický cyklus – vazba na sekvenci operátoru

Organizace genomu fága je stěžejní pro regulaci exprese genů Promotor L Promotor R cro gen – reprimuje lysogenní cyklus, podporuje expresi genů pro lytický cyklus cII gen – aktivátor, váže se na P RE a aktivuje expresi cI cI - represor - reprimuje lytický cyklus, váže se na P RM cIII – stabilizuje cII

LYTICKÝ CYKLUS cro je ON, cI je OFF

LYSOGENNÍ CYKLUS cro je OFF, cI je ON

Figure Lysogenní vs. Lytický cyklus – vazba na sekvenci operatoru

Figure represor a cro jsou DNA vázající se proteiny v konformaci „helix-turn-helix“

Figure Vedlejší řetězce aminokyseliny jsou zodpovědné za specificitu vazby

DNA vázající proteiny v konformaci „Helix-turn- helix“ První identifikovaný motiv Nachází se ve stovkách různých DNA vazebných proteinů U eukaryot a prokaryot 2 helixy s krátkým řetezcem mezi, mají fixní úhel C´ helix je důležitý pro vazbu a specificitu

DNA vázající se protein se vážou především do velkého žlábku DNA

Příklady proteinů regulující genovou expresi a DNA, kterou váží

První helix je krátký, následuje dlouhá smyčka a dlouhý helix Vazba na DNA rozdílná od HTH motivu Tvoří homodimery, nebo heterodimery DNA vázající proteiny v konformaci „Helix-loop- helix“

Proteiny obsahující zinc finger motif Proteiny obsahující strukturu β-listu (Met represor) Proteiny obsahující smyčku, jenž se váže do velkého i malého žlábku DNA (p53) Leucinové zipy Další typy DNA vazebných proteinů

 - faktory Kontrola iniciace transkripce pomocí  - faktorů  podjednotka RNAP rozeznává promotor Alternativní  faktory Sigma factor Jméno Consensus sequence -35mezera-10 Housekeeping  70 RpoDTTGACA16-18TATAAT Stationary phase  38 RpoSCCGGCG16-18CTATACT Nitrogen control  54 RpoNTTGGNA6TTGCA Flagellar motion  28 FliACTAAA15GCCGATAA Heat shock  32 RpoHCTTGAA13-15CCCCATNT Extracytoplasmic heatshock  24 RpoEGAACTT16TCTGAT

 faktor tepelného šoku – RpoH a RpoE Při vysoké teplotě  proteiny se špatně balí, ztrácí svou funkcí  agregují E.coli – 37°C – OK – 43° - pořád OK – 46°C -  exprese heat shock proteinů (30% z celkového množství proteinů) Chaperony (pomáhají správně sbalit protein) Proteázy (degradují špatně sbalené proteiny)

RpoH – 30°C – není potřebný, je rychle degradován – 42°C - protein je stabilní,  se jeho exprese – 50°C – aktivace exprese dalších heat shock genů, RpoH je posléze inaktivován – Transcripce RpoH genu je pod normálním promotorem (  70), jenž je neaktivní při teplotě nad 50°C RpoE – tento  faktor umožňující transkripci RpoH i při teplotě nad 50°C. Transkripce je ukončena pri 57°C, kdy RNAP se stává nefunkční  faktor tepelného šoku – RpoH a RpoE

Formace spory u Bacillus Kaskáda alternativních  faktorů Když je nouze o výživné látky  sporulace  faktory důležité pro vytvoření spóry –  E a  K – v mateřské buňce Pre-  E – environmentální signály zapínají expresi –  F a  G – ve sporulující buňce  F – transkripce ranných sporulujících genů (aktivují pre-  E)  G – transkripce pozdních sporulujících genů (aktivují pre–  K)

Regulon Regulon – skupina genů a operonů, které jsou regulovány jedním regulačním proteinem při spuštění jednoho signálu – syntéza argininu ( 12 různých genů/operonů) regulovány jedním represorem – Metabolismus cukrů – globální aktivátor cAMP-CAP – Alternativní sigma faktory reagující na změnu prostředí

Manipulace s DNA Restrikční a modifikační enzymy Nukleázy DNA nukleázy – Dnázy RNA nukleázy – Rnázy Exonukleázy Buď 5‘ nebo 3‘ specifické exonukleázy Endonukleázy ssDNA dsDNA Specifické (restrikční enzymy) Nespecifické

Restrikční enzymy Vyvinuty jako obrana baktérií proti cizí DNA/RNA (např. viry) Vysoce specifické endonukleázy, rozeznávající 4 až 8 nt Štípou obě vlákna Mechanismus jak rozlišit svou DNA od cizí Methylace (methylázy) adeninu, nebo cytosinu v DNA sekvenci

Restrikční enzymy – typ I Prvně objeveny restrikční enzymy Rozeznávací místo tisíce bp od stěpícího místa Reakce proběhne pouze 1x ATP dependentní 3 podjednotky – HsdS - DNA vazebná (rozeznává DNA sekvenci) – HsdM – modifikační, methyluje DNA – HsdR - enzym - štípe

Restrikční enzymy - typ II Rozeznává specifické místo, aktivita je SPECIFICKÁ Dimer Nepotřebují ATP Potřebují kofaktor (MgCl 2 ) Palindrom (4 – 8 bází) Lepivé konce vs. slepé konce

Hojně využívány v genetickém inženýrství Rozeznávají „ inverted repeat – PALINDROM > několik stovek enzymů Palindrom 4, 6 či 8 nukleotidů Isoschizomery: – NarI – BbeI – EheI – KasI GGCGCC CCGCGG Restrikční enzymy - typ II

EnzymOrganismusSekvence HpaIHaemophilus parainlfuenzaeC/CGG NdeIINeisseria denitrificans/GATC EcoRIEscherichia coli RY13G/AATTC EcoRVEscherichia coli J62/pGL74GAT/ATC BamHIBacillus amyloliquefaciensG/GATCC BglIBacillus globigiiGCCNNNN/NGGC NotINocardia aotidis-caviarumGC/GGCCGC DraIIDeinococcus radiophylusRG/GNCCY Restrikční enzymy - typ II

Uplatnění lepivých konců při klonování Restrikční enzymy - typ II

Analýza polymorfismu restrikčních fragmentů - RFLP – Identifikace organismu – Forénzní genetika – Určování otcovství

Využití restrikčních enzymů - klonování Molekulární klonování – PCR – Ligace do PCR vektoru – Restrikční analýza – Ligace do jiných vektorů – Použití: KNOCK-OUT KNOCK-IN Exprese genů - proteinů

Klonování PCR produktu pGEM-T easy (Promega) XL1-Blue Genotype: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)].

Modro-bílá selekce V laboratoři při klonování Gen je klonován do lacZ genu X-gal Bílé kolonie jsou pozitivní

Ověření úspěšnosti klonování Namnožení pozitivních bílých baktérií Izolace plasmidové DNA Restrikční analýza Agarózová gelová elektroforéza – Ethidium bromide (interkalační činidlo)

PCR Klonování do PCR vektoru Klonování do specifického vektoru Ověření úspěšnosti klonování

Southern blot analýza – přenos na membránu Jedna z nejpoužívanějších metod molekulární biologie E.M Southern (1975) – Přenos DNA molekul na membránu nylonovou nebo nitrocelulozovou membránu – Identifikace specifického restrikčního fragmentu Western blot – detekce proteinů Northern blot – detekce RNA

Hybridizace: – Vytvoření značené (radioaktivně) próby Náhodné hexa – deca primery [  - 32 P] dATP* dCTP, dTTP, dGTP DNAPI – Klenow fragment Southern blot analýza – detekce pomocí radioaktivní próby

Hybridizace: – Vytvoření značené (radioaktivně) próby – Inkubace s membránou – Vyvolání na rentgenový film Southern blot analýza – detekce pomocí radioaktivní próby

Důležité pojmy k zapamatování Aktivátor Represor Promotor Operátor Alosterická regulace Pozitivní regulace Negativní regulace Alternativní sigma faktor Atenuace Cis-acting Trans-acting Lytický cyklus Lysogenní cyklus Lambda represor Cro a cI Operon Polycistronická RNA lac operon Indukce IPTG Modro-bílá selekce Trp operon Ara operon cAMP

Regulace transkripce Na úrovni přístupu transkripčních faktorů k DNA Důležitější u E (heterochromatin) U P – ne až tak důležitá Na úrovni rozeznání promotoru U E – tři různé RNAP U P – 1 RNAP, ale různé  faktory Na úrovni iniciace transkripce Nutná přítomnost aktivačních proteinů Represor blokuje postup RNAP Na úrovni elongace mRNA Ne úplně běžné (zpomalení elongacem či předčasné ukončení transkripce) Na úrovni terminace mRNA Anti-terminator proteiny Umožňuje transkripci genů downstream od terminátoru

Ko-represory Některé represory jsou aktivní pouze, pokud vážou nějakou molekulu Velmi časté u biosyntetických metabolických drah Příklad: arginin

Represory vázající se na protein Mlc – Represe genů účastnící se metabolismu glukózy – Při absenci glukózy, transporter PtsG je fosforylován – Přítomnost glukózy vede k jeho defosforylace – PtsG váže Mls – Exprese genů je spuštěna

Kovalentní modifikace represorů a aktivátorů OxyR – Oxidace OxyR peroxidem vodíku – Oxiduje –SH skupiny na S-S skupiny – aktivace a vazba na DNA – Spuštění exprese genů na protekci proti oxidativnímu stresu Fnr – Redukce Fnr spouští jeho aktivní funkci - dimerizuje (např. při anaerobních podmínkách) – Aktivace genů důležitých pro anaerobní respiraci

Dvousložkový regulační systém Přidání chemické skupiny pomocí kovalentní vazby (fosfát, methyl, acetyl, AMP, ADP-riboza atd.) 2 složky – DNA vázající protein, váže DNA pouze když je fosforylovaný (REGULATOR) – Kináza vnímavá na změny prostředí (SENSOR) – Příklady: Nedostatek kyslíku (ArcB a ArcA) – reprimuje 20 genů, které jsou nutné pouze při aerobním metabolismu, aktivuje 6 genů nutné pro růst za anearobních podmínek Deprivace fosfátu (PhoR a PhoB) Metabolismus dusíku (NtrB a NtrC) Regulator Sensor

Globální regulace - Crp Crp - cyclic AMP receptor protein Crp zapíná geny pro metabolismus maltózy, laktózy a dalších při absenci glukózy cAMP je signál, že buňka má málo glukózy Lac operon je tudíž řízen nejenom lacI, ale take Crp Cyclic AMP dimer

Regulační nukleotidy – cAMP cAMP je produkování adenylát cyklázou Přítomnost glukózy inhibuje syntézu cAMP, stimuluje export cAMP ven z buňky – cGTP – vyšší organismy – c-di-GTP - důležitý pro biofilm produkující baktérie Reguluje tranzici mezi volně-plavající a biofilm vytvářející bakterií Produkce polymeru N-acetyl-D-glucosaminu Biofilm umožňuje baktérií přilnout k povrchu (př. Yersinia pestis, mor, blecha) – ppGpp – kontrola hladovění u baktérií

Regulační nukleotidy – druhý posel Když není glukóza Když je glukóza Když nejsou aminokyseliny

Anti- a anti-anti-sigma faktory Anti sigma faktory se vážou na  faktory a zabraňují nasednutí na promotor SpoIIAB je anti-sigma faktorem pro  F SpoIIAA je anti-anti sigma faktorem a uvolňuje  F

DNA vázající proteiny Histone-like proteiny – Nepřímé – nespecifické H-NS (histone-like nucleoid structuring) – 2 domény: DNA vazebnou doménu Protein-protein interakční doménu Agregují (tetramery) – Vazba na A/T bohaté oblasti – reprimují expresi

Regulace na dálku HU (heat unstable nucleoid protein) a IHF (integration host factor) – Pozitivní regulátory – Heterodimery – Ohýbají DNA – Pomáhají tak genovým inverzím, integracím, rekombinacím – Regulují expresi přiblížením regulačních proteinů

Regulace na dálku Geny pro metabolismus dusíku Alternativní  54 (RpoN) Aktivátor NtrC – vazebné místo -140 bp Aby byl umožněn kontakt s RNAP  ohyb pomocí IHF Prokaryotický enhancer

Anti-terminace Anti-terminace jako kontrolní mechanismus – Prevence terminace na specifickém místě – Transkripce pokračuje – Běžné u virů a pro některé bakteriální geny – Anti-terminační faktor se váže na RNAP před dosažením terminačního místa