Analýza volné fetální DNA Iveta Valášková

Zdroje fetální DNA Invazivní výkony –amniové fibroblasty – při amniocentéze 0,5-1% riziko spontánních potratů, 17% riziko FMH0,5-1% riziko spontánních potratů, 17% riziko FMH –choriové klky 0,5-1% riziko spontánních potratů, nízké riziko FMH0,5-1% riziko spontánních potratů, nízké riziko FMH –fetální krevní buňky – při kordocentéze vyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézyvyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézy vysoké riziko aloimunizace matkyvysoké riziko aloimunizace matky

Zdroje fetální DNA Neinvazivní výkony –fetální buňky v mateřské periferní krvi neuplatnilo se pro nevýhodný poměr mateřských a fetálních buněkneuplatnilo se pro nevýhodný poměr mateřských a fetálních buněk technologicky obtížné oddělení fetálních a mateřských buněktechnologicky obtížné oddělení fetálních a mateřských buněk –volná (nebuněčná) fetální DNA fetální DNA z plazmy matkyfetální DNA z plazmy matky množství fet. DNA stoupá v průběhu těhotenstvímnožství fet. DNA stoupá v průběhu těhotenství –abnormálně vysoké hladiny fet. DNA u patologických těhotenství

Volná fetální DNA volná fetální DNA rozptýlená v plazmě matkyvolná fetální DNA rozptýlená v plazmě matky v krvi matky byla objevena v roce 1997 koncentrace se postupně zvyšujekoncentrace se postupně zvyšuje I. trimestr do 3 % I. trimestr do 3 % III. trimestr až 6 % III. trimestr až 6 % fet. DNA po porodu rychle mizí z cirkulacefet. DNA po porodu rychle mizí z cirkulace –po císařském řezu za 4 – 30 min. –po vaginálním porodu za 10 – 100 hodin

Odběr periferní krve matky odebírá se min. 8 ml periferné krve matkyodebírá se min. 8 ml periferné krve matky termíny odběru je vhodné navázat na již existující schémata – gynekologická, genetickátermíny odběru je vhodné navázat na již existující schémata – gynekologická, genetická –určení krevní skupiny matky – 12. týden riziko nedostatečného množství fetální DNAriziko nedostatečného množství fetální DNA –biochemický screening (MS AFP) – týden většinou dostačující množství fetální DNAvětšinou dostačující množství fetální DNA termín pro určení genotypu je do týdnetermín pro určení genotypu je do týdne

Odběr krve pro analýzu volné fetální DNA z krve matky odběr krve (0,5M EDTA): 8-9ml izolace DNA matky z krve izolace volné nebuněčné DNA plodu z plazmy mateřské krve okamžitá analýza

Možnosti detekce fetální DNA na OLG RH faktor –Genotypizace RHD ( ex.7/ex10) Pohlaví plodu –detekce sekvence specifické pro chromozom Y v krevní plazmě těhotných žen (gen SRY) Možnost detekce mutace paternálního původu

RH faktor Rh faktor byl poprvé popsán v roce 1939 (Landsteiner, Wiener). DNA studie prokazují přítomnost dvou forem Rh genu D a CE na chromozomu 1. D gen kóduje D antigen. Každá ze 4 alternativních forem CE genu produkuje jednu ze čtyř možných kombinací antigenů ce, CE, Ce, cE. Je prokázáno, že lidé s absencí D formy genu mají CE genovou formu a absence 400 aminokyselin dlouhého řetězce D antigenu nevede k jakékoliv dysfunkci erytrocytární membrány, již by bylo možno očekávat v souvislosti s nepřítomností tak významné molekulární struktury, která ovšem na druhé straně způsobuje velkou imunogenicitu spojenou s příchodem D antigenu do krve D- jedinců. Imunitní odpověď tedy spočívá v rychlé tvorbě protilátek anti-D a je způsobena kompletní absencí D antigenu na membráně erytrocytů D- fenotypu. Potenciálně silná imunitní odpověď na D antigen u D- příjemce je jednoznačným důvodem k pečlivému pretransfúznímu vyšetření.

RH faktor Význam Rh při hemolytické nemoci novorozenců Protilátky Rh systému, zejména anti-D a anti-c jsou schopny způsobit hemolytickou nemoc novorozenců. Anti-D jsou její nejčastější příčinou a objevují se povětšinou v kombinaci s dalšími protilátkami Rh systému anti-D+C, anti-D+E.

Genotypizace RHD genu gen RHD obsahuje 10 exonů, část sekvencí shodná s RHCE genemgen RHD obsahuje 10 exonů, část sekvencí shodná s RHCE genem více různých protokolů – detekce exonůvíce různých protokolů – detekce exonů –exony 7 a 10 – Roullilac 2007, Hromadníková 2003 –exony 4, 5 a 10 – Daniels 2004, Minon 2005, 2007 –exony 5 a 10 – Christiansen 2007 –exony 5 a 7 – Grootkerk 2006, Legler 2007 –exony 4 a 7 – Singleton 2000 komerční kitykomerční kity –Devyser RHD kit (čeká na udělení CE-IVD) - exon 4

Genotypizace RHD genu doporučení testovat nejméně 2 exony (kontrola)doporučení testovat nejméně 2 exony (kontrola) kombinace exonů 7 a 10 je v současnosti otestovaná k použití v ČRkombinace exonů 7 a 10 je v současnosti otestovaná k použití v ČR u kombinace exonů 5 a 7 lze u černošské populace detekovat pseudogen RHDΨ (hlavní D-negativní alela Afričanů)u kombinace exonů 5 a 7 lze u černošské populace detekovat pseudogen RHDΨ (hlavní D-negativní alela Afričanů) –v ČR je zatím tato minorita zanedbatelná

Metodika genotypizace RHD genu Amplifikace RHD genu ve fetální DNA –metoda kvantitativní fluorescenční PCR na real-time PCR Interní kontroly amplifikace  amplifikační kontroly (β-globin)  stanovení pohlaví –gen SRY

Stanovení pohlaví a Rh faktor - výsledek QF PCR (LightCycler 480)