Molekulární a buněčná biologie pro biofyziky Ondřej Štěpánek Ústav molekulární genetiky, AV ČR ZS 2009/2010
Program 1.Úvod (buňka) + modelové organizmy 2.Molekulární genetika Tok genetické informace, DNA metabolizmus, genová exprese, virologie 3.Buněčná fyziologie Membrány, reprodukce, dynamika buňky, signalizace 4.Metody v molekulární biologii Biochemické metody, genové inženýrství, fluorescenční proteiny Zkouška Státní závěrečná zkouška
Studijní materiály Bruce Alberts et al. (2008): Molecular Biology of the Cell. Garland Science, 5 TH Edition Harvey Lodish et al. (2007): Molecular Cell Biology. Garland Science, 6 TH Edition Bruce Alberts et al. (1999): Základy buněčné biologie. Úvod do molekulární biologie buňky. Espero Publishing, České vydání + různé učebnice biochemie, české učebnice, wikipedie
PubMed
Úvod A. Úvod do (buněčné) biologie B. Buňka C. Modelové organizmy
A. Biologie: Definice života Poměrně obtížná Znaky živých organizmů (buněk): A)Reprodukce (buňka jen z buňky) B)Vnitřní uspořádanost (daleko od rovnováhy) C)Tok energie (metabolizmus), informace D)Evoluce (dědičnost, mutace, selekce)
Základy obecné biologie 1)Buněčná teorie organizmy se skládají z buněk 2)Darwinova evoluční teorie dědičnost, mutace, selekce 3)Mendelovy genetické zákony nezávislá segregace alel, gen 4)Molekulární genetika gen (úsek DNA) → protein
Molekulární a buněčná biologie ImunologieVývojová biologie Neurobiologie Onkologie Virologie Bakteriologie Genové inženýrství Parazitologie Rozvoj molekulární biologie
B. Buňka: Složení Voda (bakterie 70 %) Informační biopolymery (DNA 1 %, RNA 6 %, proteiny 15 %) Sacharidy (2 %) Fosfolipidy (2 %) Ionty a malé metabolity (4 %) Molekulární interakce: kovalentní vazby iontové interakce van der Waalsovy síly vodíkové můstky hydrofóbní interakce
Proteiny = "nářadí buňky" Struktura: Primární: aminokyselinová sekvence (N a C konec) Sekundární: základní motivy - α helix, β sheet Terciální: konformace, tvar (včetně nábojů atp.) Kvarterní: interakce více proteinových molekul 20+2 aminokyselin, liší se postranním řetězcem Doména x motiv Hemoglobin
Proteiny II Aminokyseliny podle náboje (polarity): Hydrofóbní Polární nenabité Kyselé Bazické
Nukleové kyseliny = "nosiče informace" Struktura: Primární: sekvence nukleotidů (deoxynukleotidů), 5´ a 3´ konec Sekundární: párování bazí (G≡C, A=T, A=U), šroubovice Terciální: prostorové uspořádání DNA: CGAT, 2´deoxy RNA: CGAU, 2´OH
Nukleové kyseliny Struktura: Primární: sekvence nukleotidů (deoxynukleotidů), 5´ a 3´ konec Sekundární: párování bazí (G≡C, A=T, A=U), šroubovice Terciální: prostorové uspořádání Antiparalelní, pravotočivé, velký žlábek, malý žlábek, A: RNA, DNA-RNA B: DNA
Nukleové kyseliny Struktura: Primární: sekvence nukleotidů (deoxynukleotidů), 5´ a 3´ konec Sekundární: párování bazí (G≡C, A=T, A=U), šroubovice Terciální: prostorové uspořádání
Polymorfismus nukleových kyselin (struktury) Může se vyskytnout u státnic - nastudujte si!
Buněčné membrány Fosfolipidová dvojvrstva (+ glykolipidy, cholesterol) Proteiny (integrální, periferní, kotvené) Tekutá mozaika Asymetrie: 1. Různé složení vnějšího a vnitřního listu 2. Laterální – lipidové rafty α helix (hydrofobní PŘ) β barel HFO ven HFI dovnitř HFO kotvy Asociované proteiny
Buněčné struktury 3 základní typy buněk: 1.Bacteria 2.Archae 3.Eukarya Prokarya
Bakterie Znaky: 1)Malá velikost – jednoduchá stavba 2)Vždy jednobuněčné (x posun paradigmatu) 3)Vysoká rychlost reprodukce Charakteristika: 1)Nemají vnitřní členění 2)Haploidní genom, nepohlavní množení (parasexuální přenos gen. informace)
Stavba bakteriální buňky 1.Nukleoid (~jádro): kruhová molekula DNA + proteiny 2.Plazmatická membrána (+ vchlípeniny "Mesozómy") 3.Buněčná stěna + povrchové struktury 4.Cytosol Ad 3. Pouzdro (PS nebo protein), ochrana Glykokalyx polysacharidy, adheze Brvy, bičíky Ad 4.Ribozómy Veškeré enzymy Zásobní látky (polysacharidy) VIDEO
Typy bakteriální buňky Barvení podle Grama: G +, G -, G 0 Celá řada různých tvarů E.c. B.s.
Eukaryota Vnitřní členění buňky (kompartmentace) Častá mnohobuněčnost (nezávisle na sobě) Delší generační doby Komplexnější reakce na vnější podněty Animalia FungiChromista PlantaeProtozoa
Stavba eukaryotické buňky Kompartmenty = membránou ohraničené struktury: Jádro Semiautonomní organely: mitochondrie, plastidy Endoplazmatické retikulum Golgiho aparát Lysozómy/Vakuoly Peroxizómy Další váčky Cytosol
Typy eukaryotních buněk 1.Podle organizmu: houba x rostlina x živočich 2.Podle typu buňky: neuron x lymfocyt atp. * * Amyloplast
Jádro Obsahuje DNA (většinou více lineárních molekul v komplexu s histony) Probíhá zde replikace, transkripce, RNA processing Jaderný obal – dvojitá membrána (navazuje ER) Vizualizace pomocí DNA barvení (DAPI, Hoechst 33342) Jaderný pór (doprava mezi jádrem a cytosolem) Jadérko (syntéza a úprava ribozomální RNA)
Endoplazmatické retikulum Drsné (ribozómy) x hladké Sekreční dráha Posttranslační úpravy proteinů Metabolismus mastných kyselin Syntéza lipidů Syntéza membrán Zásoba Ca 2+ iontů Golgiho aparát Cisterny + váčky Sekreční dráha Posttranslační úpravy proteinů
Vakuola a lysozómy Buněčné trávení (endocytóza, autofagie), proteolýza Úložná funkce (odpadní látky, zásobní látky, ionty) Detoxifikace Růst buňky (turgor) (rostliny, houby) Speciální funkce (např. kontraktilní vakuola u prvoků) Endocytóza, exocytóza
Semiautonomní organely Původ: endosymbiotické bakterie Vlastní DNA: replikační, transkripční i translační aparát (ribozómy) Energetický metabolizmus
Původ semiautonomních organel
Mitochondrie Vnější membrána, mezimembránový prostor, vnitřní membrána (kristy), matrix Krebsův cyklus, β oxidace (pouze živ.), dýchací řetězec, role v programované buněčné smrti Procesy probíhají zejména v matrix a na vnitřní membráně VIDEO
Plastidy Chloroplasty – fotosyntéza, jiné plastidy zásobní funkce Vnější membrána, mezimembránový prostor, vnitřní membrána, stroma, tylakoidy (lumen) Primární procesy fotosyntézy: membrána tylakoidů Sekundární procesy fotosyntézy: stroma
Buněčná stěna Rostlinné buňky: celulóza, hemicelulóza Houby: chitin Kvasinky: β glukany, chitin (minoritně) Funkce: mechanická opora, regulace osmózy Peroxizómy β oxidace mastných kyselin Produkce peroxidu vodíku
C. Modelové organizmy v molekulární biologii
Důvody pro preferenci modelových organizmů Kultivace (náročnost, generační doba) Financování = Aplikace (medicína, biotechnologie, zemědělství) Metodika (genové inženýrství) Stupeň znalostí (známá sekvence genomu?)
Bacteria Escherichia coli Střevní G - bakterie Genom 4,6 Mbp genů Základní molekulární mechanismy, DNA technologie Bakteorologie Mycoplasma genitalium Parazitická bakterie 0,6 Mbp – 468 genů Projekt minimálního genomu Bacillus subtilis Půdní G + bakterie 4,2 Mbp – 4099 genů Sporulace, stres Dále významné lidské patogeny: Mycobacterium tuberculosis Helicobacter pylori atp.
Protozoa + Fungi Dictyostelium discoideum Půdní hlenka Genom 43 Mbp, 8-10 tis. genů Komunikace, diferenciace Saccharomyces cerevisiae Pivovarská (pučící) kvasinka Genom 12 Mbp, 6300 genů Buněčný cyklus, sekreční dráhy Neurospora crassa Vláknitá houba Genom 43 Mbp, genů Circadiánní rytmy, genetika Dále významné lidské patogeny: Candida albicans Trypanosoma brucei Trichomonas vaginalis
Plantae Arabidopsis thaliana Huseníček rolní, plevel Genom 120 Mbp, genů Oryza sativa rýže Genom 430 Mbp, cca genů Nicotiana tabaccum BY-2 tabáková buněčná kultura Zea mays kukuřice Genom cca 2500 Mbp
Bezobratlí Drosophila melanogaster octomilka Genom 137 Mbp, genů vývoj, signální dráhy, genetika Caenorhabditis elegans hlístice Genom 97 Mbp, genů vývoj, signální dráhy
Obratlovci Xenopus laevis Drápatka Genom 1700 Mbp, cca genů vývojová biologie Mus musculus Myš domácí Genom 3000 Mbp, tis. genů imunologie, molekulární genetika Homo sapiens člověk Genom 3000 Mbp, genů
Shrnutí Neexistuje "univerzální buňka". "Obecně platné hypotézy" vychází z pozorování na omezeném počtu organizmů. Jednotlivé organizmy mají různé výhody a nevýhody. Některé vhodné vlastnosti modelových organizmů se často vzájemně vylučují např. lepší aplikovatelnost → horší kultivace (patogeny, vyšší organizmy ) Výběr organizmu závisí na specifických požadavcích výzkumníka.