Fluorescenční mikroskopie & její využití ve forenzní vědě EVROPSKÝ SOCIÁLNÍ FOND PRAHA & EU INVESTUJEME DO VAŠÍ BUDOUCNOSTI Podpořeno CZ.2.17/3.1.00/36021 Implementace nových metod ve výuce biochemie a forenzní analýzy.

Emise záření spontánně nastávajícího při přechodu molekuly z excitovaného stavu do základního - Fotoluminiscence (fluorescence, fosforescence) - excitace je způsobena absorpcí záření - Chemiluminiscence – excitace je vyvolána chemickou reakcí Luminiscence fosforescence - trvá-li emise až několik sekund po přerušení excitace fluorescence - emise světla pouze v průběhu absorpce excitačního světla – interval mezi absorpcí excitačního světla a emisí je extrémně krátký (<1/ s)

pojem „fluorescence" pochází od Sira George G. Stokse, který objevil, že ozařováním fluoritu (kazivec, CaF 2 ) UV světlem lze vyvolat fluorescenci primární fluorescence (autofluorescence) - přirozená fluorescence studovaného materiálu (minerály, krystaly, máslo, chlorofyl, vitamíny, některé anorganické sloučeniny) sekundární fluorescence - studovaný materiál je "označen" fluoreskující značkou (např. fluorescenčně značené protilátky) Fluorescence

základní úkol fluorescenčního mikroskopu je sice dovolit vstup excitačního světla na vzorek, ale současně ho separovat od mnohem slabší emitované fluorescence vysoká citlivost (50 fluorescentních molekul na μ 3 ) možnost vícenásobného značení pod rozlišením pořád můžete říct, zda tam molekula fluoreskuje nebo ne použití pro organický materiál (fixované či živé vzorky) i anorganický (obzvláště kontaminanty polovodičů) mnoho rostlinných i živočišných tkání samovolně fluoreskuje při ozáření světlem krátké vlnové délky (autofluorescence) x fluorochromy - často vysoce specifické, s velkým kvantovým výtěžkem

spektrální překryv - nutno odfiltrovat volbou vhodného excitačního filtru nebo dichromatickým děličem paprsku – jinak ztráta kontrastu kvůli přesvícení excitačním světlem pro každý fluorochrom je dán vrchol excitace a vrchol emise (nalezeno monochromátorem a měřením relativní intensity fluorescence) čím větší tzv. stokesův posun, tím snazší je separovat excitaci od emise Jablonského diagram

První fluorescenční mikroskop Otto Hemstädt + Heinrich Lehmann - pozorování autofluorescence v bakteriích, zvířecích a rostlinných tkáních 1940 Albert Coons - značení protilátek fluorescentní barvou - zakladatel imunofluorescence kategorie molekul schopných projít elektronovými transicemi, zodpovědnými za fluorescenci se nazývají fluorochromy Fluorochromy konjugované coby značky k větším molekulám (jako jsou nukleové kyseliny, lipidy, enzymy či proteiny) prostřednictvím kovalentních vazeb nebo adsorbce se nazývají fluorofory. Fluorofory se dělí na vnitřní - aromatické aminokyseliny, porfyriny a GFP, tj. přirozeně se vyskytující vnější - syntetické barvy či modifikované biochemikálie, přidané ke vzorku pro získání fluorescence se specifickými spektrálními vlastnostmi fluorofory obecně mohou projít excitačním cyklem řádově tisíckrát, než dojde k jejich destrukci (fotovybělení), např. FITC (fluorescein isothiokyanát) může projít cyklem excitace-relaxace cca x, než ztratí schopnost reagovat na iluminaci FIT C TRITC

Fluorofory Aequorea victoria GFP přírodní uměle vytvořené, většinou modifikací těch přírodních aplikace in vivo: fluorescenční značky pro vazbu na specifický protein pro lokalizaci do určité specifické oblasti (cytoskeleton, mitochondrie,...). pro sledování dynamických procesů a proměn prostředí monitoring buněčné integrity (živá, mrtvá, apoptotická) sledování exocytosy, endocytosy sledování fluidity membrán, transportu proteinů, enzymatické aktivity, ….. příklady: akridinová oranž - silná vazba na DNA DAPI - barvení DNA a chromatinu Alexa Fluor - vysoký kvantový výtěžek, zvýšená fotostabilita cyaniny - vysoká stabilita spektrálně sensitivní indikátory - Fluo-3, Fura Red značení organel - MitoTracker, LysoTracker quantum dots - polovodičové krystaly cca nanometry fluorescentní proteiny

u fluoroforu hodnotíme: extinkční koeficient kvantový výtěžek životnost fluorescence extinkční koeficient, resp. molární extinkční koeficient - míra schopnosti fluoroforu absorbovat světlo převod jednotek absorbance na jednotky molární koncentrace pro řadu látek (možné porovnání) - získá se měřením absorbance při referenční vlnové délce (charakteristické pro absorbující molekulu) pro jednomolární koncentraci; chromofory s vysokým EK budou s vysokou pravděpodobností mít schopnost fluorescence kvantový výtěžek - míra efektivity fluorescenční emise vzhledem k ostatním způsobům relaxace bývá vyjádřen jako poměr počtu emitovaných fotonů ku počtu fotonů absorbovaných (de facto pravděpodobnost, že daný excitovaný fluorochrom vyzáří foton; nabývá typicky hodnot 0-1). Pro většinu aplikací upřednostňujeme fluorofory s vysokým kvantovým výtěžkem, ten je ovšem dramaticky závislý i na vnějším prostředí (viskozita solventu, iontová síla, pH, hydrofobicita) životnost fluoroforu - průměrný čas, po který zůstává molekula v excitovaném stavu, než emituje foton obvykle používané fluorescentní sloučeniny mají životnost 0, nanosekund Fluorofory

existují podmínky, které ovlivní reradiaci světla excitovaným fluoroforem, redukujíce intensitu fluorescence – blednutí či fotovybělení (fading, photobleaching) blednutí dělíme na vybělení (bleaching) a zhasínání (quenching) vybělení – nevratný rozklad fluorescentních molekul v důsledku vysoké intenzity světla v přítomnosti molekulárního kyslíku (trvalá ztráta schopnosti fluoreskovat v důsledku fotonem indukovaného poškození). závisí na konkrétním fluoroforu a jeho okolí, kolik cyklů excitace-emise dokáže prodělat než je vybělen - některé fluorofory několik, jiné tisíce i miliony cyklů fotovybělení se dá zabránit  omezením expozice fluoroforů iluminační energii, tím se ovšem snižuje signál fluorescence  deoxygenací roztoku fluoroforu, což je ovšem problematické např. u živých buněk. Iluminace se proto omezuje na co nejmenší použitelný čas a tato technika se kombinuje s komerčně dostupnými reagenciemi, snižujícími vybělení FRAP – Fluorescence Recovery After Photobleaching (difuse fluoroforů do laserem vybělené oblasti) lze sledovat difuzi v malé oblasti buňky (2-5 μm, buňka má i 100 μm) VIDEO Fading - vybělení

existují činidla bránící blednutí Efekt rozpouštědla na emisi fluorescence: mnoho faktorů prostředí ovlivňuje fluorescenci, včetně interakcí mezi fluoroforem a molekulami rozpouštědla, ostatními rozpuštěnými anorganickými nebo organickými sloučeninami pH, teplota, lokální koncentrace fluoroforů lze ovlivnit absorpční spektrum, emisní spektrum, kvantový výtěžek

jádra barvena DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole; modrá fluorescence) mitochondrie barveny MitoTracker Red (červená fluorescence) aktinová vlákna (cytoskelet) barvena derivátem falloidinu (zelená fluorescence) snímky á 2 min

zhasínání - z mnoha procesů, indukujících neradiační relaxaci (bez vyzáření fotonu) excitovaných elektronů do základního stavu - procesy intramolekulární nebo intermolekulární. Neradiační relaxace soutěží s fluorescenční relaxací, obvykle dramaticky snižují nebo dokonce úplně zruší emisi. Principem většiny zhasínání je redukce životnosti excitace a kvantového výtěžku ovlivněného fluoroforu kolizní zhasínání - kolize excitovaného fluoroforu a jiné nefluorescentní molekuly v roztoku, výsledkem je deaktivace fluoroforu, většinou bez chemické modifikace molekul. mnoho kolizních „zhášečů“ - kyslík, halogeny, aminy a mnoho elektron-deficientních organických molekul. lze využít pro detekci přítomnosti „zhášeče“ v určitém místě buňky statické či komplexní zhasínání - vytvoření nefluorescentního komplexu mezi zhášečem a fluroforem - snížení absorpce snižením počtu aktivních excitovatelných molekul. Tvoří se vratný komplex quencheru s molekulou v základním stavu, tento jev není závislý na kolizi či difusi, emise fluorescence je snížena bez ovlivnění délky excitovaného stavu. FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer – měření vzdáleností daleko menších, než je rozlišení světelného mikroskopu Fading - zhasínání

VIDEO FRET Jablonského diagram pro FRET Förster (Fluorescence) resonance energy transfer transfer energie mezi dvěma chromofory, efektivita přenosu je nepřímo úměrná šesté mocnině vzdálenosti mezi donorem a akceptorem (reálná hranice je 10 nm) umožňuje studovat interakci mezi dvěma různými molekulami (proteiny). molekuly označeny odlišnými fluorochromy, emisní spektrum jednoho se překrývá s excitačním spektrem druhého při interakci molekul se jejich fluorochromy dostanou velice blízko, energie excitovaného světla se může přenést z jednoho fluorochromu na druhý při osvícení komplexu excitačním světlem prvního fluorochromu vidíme emisní světlo odpovídající druhému fluorochromu celá řada aplikací

Zdroj světla ve fluorescenci množství fotonů, které dorazí do oka nebo na detektor je při fluorescenční mikroskopii zpravidla velmi malé - kvantový výtěžek většiny fluorochromů je malý pro dostatečné množství emisního světla nutno používat velmi silné zdroje excitace obvykle obloukové lampy (výbojky), nejčastější jsou rtuťové lampy od 50 do 200 wattů a nebo xenonové výbojky wattů zdroj musí zajistit dostatek energie pro zažehnutí výbojky (ionizací plynných par) a na udržení hoření s minimem blikání většinou počítadlo na zdroji, lampa má omezenou životnost, pak klesá efektivita - řádově stovky hodin (cca 200 rtuťová, cca 900 xenonová) rtuťová lampa neposkytuje uniformní osvětlení v celém spektru, hlavní intensita je v UV oblasti, xenonová je uniformnější, ale deficientní v UV oblasti (naopak září hodně v IČ oblasti, musí se dobře chladit) lampy se liší velikostí (oblouk se musí vejít do apertury, jinak mrháte světlem), jasností

Zdroj světla ve fluorescenci někdy se používají wolframovo-halogenové žárovky, obzvláště pro modrou či zelenou excitaci u silně emitujících vzorků relativně uniformní výstup, deficientní v blízkoUV oblasti nevyžadují drahé zdroje (stačí nizkonapěťový transformátor), vydrží ale jen hodin v poslední době se často používají lasery, obzvláště argonový laser drahé, ale pro některé aplikace nezbytné (laser scanning confocal microscopy) mnoho různých typů s unikátními emisními spektry

Fluorescenční mikroskop dakrfield kondenzátor brightfield fluorescence rané fluorescenční mikroskopy využívaly pouze tzv. diaskopickou fluorescenci, čili iluminaci průchozím světlem excitační filtr byl umístěn na světelném vstupu a barierový filtr, blokující residuální excitační světlo a propouštějící emisní světlo byl nad objektivem u brightfield fluorescence je poměrně obtížné separovat excitační světlo od fluorescence, protože obě světla vstupují do objektivu, proto se začaly používat olejové dakrfield kondensory (excitační světlo nevstupuje do objektivu) relativně snadná instrumentace, ale dost nevýhod - obtížné centrování kondensoru do optické osy, často nutno snížit NA vřazením clony, aby excitační světlo nevstupovalo do objektivu, plýtvá se světlem a proto je i emise slabší, nelze použít simultánně s fázovou mikroskopií nebo Nomarskim

Fluorescenční mikroskop fluorescenční mikroskopie v dopadajícím světle - epifluorescence poprvé 1920 pro metalurgické vzorky daleko vyšší jas, než u fluorescenčních mikroskopů v procházejícím světle pouze pár procent z excitačního světla se dostane do objektivu největší zlepšení dichroická zrcadla, už se nemusela používat zrcadla rozdělující světelný paprsek (na každém 50% ztráta) jas fluorescence vyzářené je 1000x až x nižší, než iluminace. Cílem je tedy zachytit toto slabé světlo a oddělit ho od excitačního, což zvládnou právě dichromatické děliče svazku

např. vzorek s fluoroforem, excitovaným v zelené oblasti (550 nm) a fluoreskujícím červeně ( nm) výkonný zdroj poskytuje široké spektrum excitačních vlnových délek, světlo narazí nejprve na filtr, který propustí vybranou vlnovou délku pro excitaci (EF). V našem případě nm (opět s nějakou účinností, takže v prošlém světle budou i jiné vlnové délky). excitační světlo dále narazí na dichromatické zrcadlo (DM) a je odraženo do objektivu, aby vytvořilo osvětlení vzorku dichromatické zrcadlo je umístěno do světelné cesty pod úhlem 45° a je vyrobeno tak, aby selektivně odráželo pouze určité vlnové délky (zde nm), zatímco kratší i delší vlnové délky propouští dichromatické zrcadlo

spektrální propouštění (crosstalk) fluorescentní emise způsobeno širokými pásy a asymetrickýmí spektrálními profily mnoha používaných fluoroforů emise jednoho fluoroforu je zaznamenána ve filtru, reservovaném pro fluorofor druhý komplikace pro interpretaci experimentálních výsledků (kamery jsou černobílé) nutno brát v potaz při výběru kombinací fluoroforů v případě vícenásobného barvení Crosstalk

zobrazovací zařízení rozhoduje o tom, jak malou fluorescenci jsme ještě schopni zachytit, případně jak rychlé procesy jsme schopni zaznamenat elektronické senzory lze popsat mnoha proměnnými: spektrální sensitivita kvantový výtěžek prostorové rozlišení stejnoměrnost poměr signál/šum dynamický rozsah rychlost odezvy PMT - photomultiplier tube (fotonásobič) APD - avalanche photodiode (lavinová fotodioda) CCD - charge-coupled device (zařízení s vázanými náboji) CMOS - complementary-metal-oxide semiconductor detector (doplňující se kov-oxid- polovodič) Dokonalý detektor neexistuje, záleží na tom, co potřebujeme nejvíce Detektory

Konfokální mikroskopie konfokální mikroskop - vyšší rozlišovací schopnost a kontrast detekováno pouze světlo z ohniskové roviny 1957 Marvin Minsky - použití bodové iluminace - "pinhole" - malý otvor v opticky konjugované rovině před detektorem, eliminující signál odjinud než z ohniskové roviny => rozlišení hlavně ve směru tloušťky vzorku je o hodně lepší lze používat tzv. optické řezy s následnou 3D rekonstrukcí na druhou stranu opět snížení intensity signálu, vyžaduje dlouhé exposice 2 základní typy skenovací konfokální mikroskop - velmi vysoké rozlišení, ale extrémně pomalé konfokální mikroskop s rotujícím diskem - nižší rozlišení, ale velmi rychlé - pro dynamické jevy v živých soustavách

DĚKUJI ZA POZORNOST