SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU

Prezentace na téma: "SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU"— Transkript prezentace:

1 SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU
4. přednáška SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU

2 Vývoj spermií - spermiogeneze
Začíná v době pohlavní dospělosti V semenotvorných kanálcích varlat Cyklicky se opakuje, jeden cyklus 40 – 70 dní Každý cyklus začíná o ¼ délky později Ve stěně kanálku 4 buňkové generace nad sebou Semenotvorné kanálky zárodečný epitel s prvopohl. buňkami Sertoliho podpůrné buňky

3 Spermiogeneze  spermatohistogeneze
Období rozmnožování (mitotické dělení) Období růstu Období zrání (meiotické dělení)  spermatocytogeneze Období metamorfózy  spermatohistogeneze

4 Ad 1) Období rozmnožování
Opakované mitotické dělení původních kmenových buněk A – spermatogonií (primordiální gonocyty) Rozdělení na dvě buňky: Typ A: velké, mateřské zásobní buňky, latentní stádium Typ Im : intermediární buňky, dále se dělí na: Buňky typu B  další dělení  spermatocyty 1. řádu

5 Ad 2) Období růstu Spermatocyty 1. řádu zvětšují svůj objem Ad 3) Období zrání Dvě po sobě jdoucí zrací dělení Redukce počtu chromozomů na polovinu, rekombinace genetických vloh Spermatocyty 1.řádudva spermatocyty 2.řádu čtyři spermatidy Poměr X a Y spermatid = 50:50

6 Ad 4) Období metamorfózy
Spermatida  spermie Ve výběžcích Sertoliho buněk Dílčí stádia: Golgiho, stadium akrozomové čepičky, stadium kaudální manžety, stadium zrání Jádro se prodlouží a oploští  hlavička Golgiho aparát  akrozom Buněčné centrioly  krček a bičík Uvolnění spermií do lumen semenotvorných kanálků a vývodných cest Postup do ocasu nadvarlete cca 12 dní

7 Schéma spermatogeneze

8 Fáze spermatogeneze

9 Stavba varlete a nadvarlete býka

10 Denní produkce spermií
Býk denně 2,5 x 109 spermií ( jeden gram testikulární tkáně vyprodukuje za 1 minutu 5-10x103 spermií) Kanec denně 15x109, druhý rok až 31x109 Hřebec 6x109 spermií denně, rezerva až 20x109 U vyčerpaných nutná sexuální pauza 4-7 dní

11 Rozměry spermií (mikrony)
Celková délka Délka hlavičky Šířka hlavičky Býk 75-80 9-10 4-5 Beran 70-80 8-9 Kanec 50-60 7-10 Hřebec 55-60 5-8 2-5 Králík Drůbež 50-120 7-14 0,5

12 Spermie různých druhů savců

13 Mikrostruktura spermie

14 Mikrostruktura spermie
Hlavička spermie: 51% hmotnosti spermie Její úloha je přenést dědičný materiál v nukleoplazmě Přední část kryta čepičkou – akrozomem Akrozom Cytoplazmatický útvar, složen z mukopolysacharidů Zaujímá 50% plochy hlavičky Nositelem specifických enzymů (hyaluronidáza, akrozin, proakrozin, kyselá fosfatáza, proteináza aj.), které rozpouštějí zonu pellucidu a cytoplazmatický obal vajíčka Citlivost na osmotické změny vnějšího prostředí (bobtnání, oddělení) Dobře barvitelný

15 Mikrostruktura spermie
Krček Spojuje hlavičku s bičíkem, 2-3µm Dva za sebou uložené centrioly, distální centriol obklopen devíti příčně segmentovanými provazci = chordami Hlavice bičíku zapadá do implantační jamky, kloubové spojení Bičík Transport spermie Mitochondriální aparát – tvorba energie Axiální vlákna – přeměna na mechanickou energii Spojovací část bičíku: Pokračováním krčku, ukončena distální centriolou Osové vlákno – 9+2 fibril + chordy (hrubá vlákna) Spirálovitá pochva – mitochondrie – respirační aparát

16 Mikrostruktura spermie
Hlavní část bičíku: Tenčí než spojovací část Podkladem je komplex vláken 2+9+9 Chordy tenčí, slepě končí Osová vlákna obaluje fibrózní pochva – pevnost a pružnost pro kmitání Koncová část bičíku: Osové vlákno není obaleno pochvou Na povrchu cytoplazmatická membrána Cytoplazmatická membrána Pokrývá celou spermii, citlivá na změnu osm.tlaku Velká permeabilita (látková výměna) Rezistentní vůči kyselému prostředí Nepropouští barvivo  metoda vitálně letálního barvení (rozlišení mrtvých a živých spermií) Odumřením ustává permeabilita

17 Fyzikálně chemické vlastnosti spermatu
Směs spermií a semenné plasmy Husté sperma: býk, beran, kozel Řídké sperma: hřebec, kanec Objem a hustota biologicky uzpůsobeny poměrům depozice do pohlavních orgánů – intravaginální x intracervikální

18 Parametry spermatu cm3 Sper. v mm3 Býk 2 – 10 5 0,2 – 2,0x106 1,0x106
Ø Sper. v mm3 Býk 2 – 10 5 0,2 – 2,0x106 1,0x106 Beran 0,5 – 2 1 0,5 – 5,0x106 3,0x106 Hřebec 20 – 300 70 0,03 – 0,8x106 0,12x106 Kanec 100 – 500 250 0,05 – 0,5x106 0,25x106 Králík 0,4 – 2,0 Kohout 0,1 – 1,5 0,5 – 7,0x106 Krocan 0,2 – 1,0 0,5 3,0 – 7,0x106 4,0x106 Kačer 0,05 – 3,0x106 Houser 0,2 – 1,5 0,8 0,5 – 1,5x106 Muž 2,0 – 6,0 3,5 0,05 – 0,15x106 0,1x106

19 Životní projevy spermií
Spotřeba energie – metabolické pochody Zdroj energie – fruktóza (glukóza), kys.mléčná Fruktolýza (glykolýza)  kyselina mléčná Dýchání (respirace)  kys.mléčná do Krebsova cyklu Průběh metabolismu: V nadvarleti inaktivace: nižší teplota, pH 5,6 – 6,6, vyšší koncentrace CO2, nedostatek fruktózy V semenné plasmě (ředidle) a pohl. orgánech samice aktivace

20 Životní projevy spermií
GLYKOLÝZA Anaerobní (bez přístupu O2) Enzymy α a β-glukosidáza Kys.mléčná – pokles pH Energie:  60% teplo, 40% pohyb Býk, beran, kozel C6H12O6+enzym  2CH3 . CHOH . COOH+E Glukóza,manóza,fruktóza,maltóza (disacharid) Hřebčí a kohoutí spermie využívají jen glukózu INDEX FRUKTOLÝZY = množství fruktózy spotřebované při 37oC v anaerobních podmínkách za 1 hodinu na 109spermií Býk 25mg, hřebec a kanec 0,2mg Přímo úměrný koncentraci a životnosti spermií

21 Životní projevy spermií
RESPIRACE Aerobní metabolismus cukrů Přeměna kyseliny mléčné 19x účinnější: 40% teplo, 60% pohyb 0,3 ml O2 na 109spermií za 1 hodinu C6H12O6 + 6O2  6 CO2 + 6 H2O + E Beraní spermie vyčerpají fruktózu v ejakulátu za 15 min, další zdroj energie = fruktóza a kys. mléčná v sekretu pohl. ústrojí samice Respirace probíhá i v pohl. orgánech samice

22 Pohyb spermií V nadvarleti nepohyblivé
Pohyb při styku se sekretem příd. pohl. žláz Zralá a zdravá spermie má přímočarý progresivní pohyb vpřed za hlavičkou Způsoby pohybu: Kmitáním bičíku Otáčivé pohyby kolem podélné osy Nejrychlejší pohyb v čerstvém spermatu Pohyb začíná od báze hlavičky a probíhá po celé délce bičíku 9 vln a 3-15 otoček za vteřinu

23 Pohyb spermií Hromadný pohyb: aktivní spermie rozvlní a uvedou do pohybu plasmu, která unáší spermie náhodným směrem Centrum pohybu: v proximální centriole krčku Směr pohybu: V ejakulátu nahodilým směrem V pohl. orgánech reotaxe = schopnost pohybu proti proudu tekutiny Rychlost spermií se zvyšuje s rychlostí proudící tekutiny, orientují se podle proudu Nežádoucí pohyb: Krouživý (může být vydatný) Otáčivý (kolem hlavičky) Vlnivý na místě Zpětný Aglutinace = shlukování spermií, ztráta záporného el. náboje (pokles pH, staré sperma)

24 Vlivy působící na aktivitu spermií
Teplota Největší pohyb při 38-41oC Při 0oC se pohyb zastavuje Při 48 – 50oC dochází ke koagulaci bílkovin optim. teplota pro uchovávání spermatu je 0-3oC u býčích spermií kritická teplota 15 – 17oC – dochází k tepelnému šoku při -1 až -17oC dochází k intenzivní krystalizaci pH Nejpříznivější 6,8 až 7,5 Pod 6,0 a nad 8,0 spermie hynou Osmotický tlak – pouze izotonický Světlo – nepříznivě působí sluneční paprsky

25 Rychlost transportu Prasnice Krávy a ovce
Spermie ve vejcovodu za 40 min. (průměrně 1-2 hod) Krávy a ovce Spermie ve vejcovodu za 4 až 6 hodin Průchod krčkem 30 min. Průchod dělohou 2 hod. Průchod vejcovodem až 8 hod. Při vaginální inseminaci zůstává 95% spermií ve vagíně

26 Faktory ovlivňující transport spermií v pohlavním traktu samice
Vnější pohlavní stimulace: Stahy svaloviny genitálního traktu Působení estrogenů Stimuly: Přítomnost samce, doteky mulcem, vzeskoky Masáž vulvy, klitorisu, krčku Zavedení katetru Aplikace oxytocinu, PGF2α U prasnice tlak na bedra Objem zavedené tekutiny Stres: faktor strachu – adrenalin snižování aktivity dělohy, zpomalení transportu

27 Faktory ovlivňující transport spermií v pohlavním traktu samice
Objem a koncentrace spermií v ID: Norma : skot 10 – 12x106 spermií prasata 1,5x109 spermií Pokusy s počtem spermií v ID U skotu se nesnížila plodnost při 9 – 14 x 106 sperm. U prasat – 5 x 109 sperm. Selekce spermií na úrovni uterotubálního spojení Do vejcovodů přicházejí živé i mrtvé spermie Semenná plasma Obsahuje PGF2α  kontrakce (kanec cca 1ng PGF2α v 1ml ) Při ředění se obsah PGF2α snižuje (opt. 1:15)

28 Semenná plazma Prostředí pro spermie (výživa, pohyb)
Ochrana proti nepříznivým vlivům Výměšky nadvarlat, Cowperových žláz, prostaty, semenných váčků, uretrálních žláz, ampulí chámovodu Výměšek nadvarlat: Bílkoviny, lipidy, K, Na pH 5,6 – 6,6, dlouho přežívají spermie Cowperovy žlázy U kance 200ml (15-18%) Odchází na začátku – zvlhčuje cesty U kance po spermiích – hustý, naplňuje děl. krček,tvoří zátku Ampule chámovodu u býka sekret s vysokou hladinou fruktózy a kys. citronové, Ca,Na,K

29 Semenná plazma Semenné váčky: Prostata: Uretrální žlázy:
Bílkoviny, fruktóza, kys. citrónová pH 5,7 – 6,2 U býka 40 – 60%, u kance 20 – 25% Na konci ejakulace, zdroj energie Prostata: pH 6,5 – 8,0 Upravuje reakci močové roury adrenalin,prostaglandin – ovlivnění děložních kontrakcí Specifický zápach Uretrální žlázy: První frakce už při erekci pH 8,0, šedobílá barva, 1-5ml.

30 Podíl semenné plasmy býk 80 – 85% beran 70 – 75% kanec 93 – 95% hřebec
90 – 95%

31 Vlastnosti semenné plasmy
Osmotický tlak: Isotonie = rovnováha Hypotonický roztok: bičík se spirálovitě stáčí, spermie bobtnají Hypertonický roztok: plasmolýza, spermie se svrašťují, bičík se skládá jako pila Koncentrace vodíkových iontů: U čerstvého spermatu pH kolem 7,0 Při fruktolýze  kys. mléčná, pH klesá pH 6,0 – anabioza, pH 5,5 – 5,0 odumření spermie Plasma býka pH 6,6 – 6,8 kance pH průměrně 7,0 hřebce pH průměrně 7,5 berana pH průměrně 7,0

32 Zásady ředění a uchování spermatu
cílem je uchovat oplozovací schopnost spermií in vitro ředění spermatu: větší objem, přežití spermií in vitro  uchování vitality a fertility, jen za stavu anabiózy konzervační roztok: stejné fyzikálně – chemické vlastnosti chrání spermie před produkty metabolismu zabraňuje chladovému šoku

33 Komponenty používaných ředidel
vaječný žloutek: obsahuje výživné látky, ochranné koloidy zvyšuje odolnost spermií proti chladovému šoku pufrovací schopnost, antikoagulační účinek nevýhoda: živná půda pro zárodky  používání pouze čerstvých vajec (max 10 dnů stáří) od slepic z chovů prostých nákaz mléko: pufrovací roztok, zabraňuje aglutinaci snižuje nebezpečí chladového šoku používá se plnotučné, odstředěné, homogenizované, laktóza kryoprotektiva: zabránění chladovému šoku glycerin výživné látky: fruktoza, laktoza, kys. citronová antibiotika: streptomycin, penicilin, linkomycin, spektinomycin po přidání antibiotik ponechat min 45 min při 5oC

34 Ředidla pro krátkodobé uchování
žloutko-citrátové: žloutek+citronan sodný žloutko-mléčné: žloutek+mléko ředidlo ze sušeného mléka: Sunar+ destilovaná voda Kare I, II: EDTA, pro kančí sperma

35 Ředidla pro dlouhodobé uchování
TRILADYL komerční ředidlo dodávané v koncentrované formě dest. voda, glycerol, kys.citronová, fruktoza, antibiotika do koncentrátu destilovaná voda + vaječný žloutek, zahřátí na 30oC LAKTÓZOVÉ ŘEDIDLO 11% vodný roztok laktózy, vaječný žloutek, glycerin míchání ve sterilním prostředí, přidávání antibiotik TRIS destilovaná voda, tris, kys.citrónová, fruktóza, antibiotika TRIS = hydroxymethyl - aminometan přidání žloutku + glycerinu Další komerční ředidla: příprava podle pokynů výrobce

36 Stanovení stupně ředění
předpoklad: inseminační dávka musí osahovat min 10mil aktivních spermií (Ps) základní hodnoty pro stanovení poměru ředění: hustota spermatu po odběru v miliardách (H) – 1100 mil v cm3 procento aktivních spermií po rozmrazení (A) – 30% objem ejakulátu (V) – 5 cm3 praktický výpočet: objem pejety 0,250 cm3 využitelný objem (ztráta na zátku,vzduch.bublinu) 0,225 cm3 při inseminaci se využije 0,190 cm3  ztráta 15% aby se do plemenice dostalo min 10mil Ps, musí celá dávka obsahovat 12 mil Ps vzorec pro výpočet počtu dávek (Pd): Pd = (V x H x A) / Ps vzorec pro výpočet množství přidávaného ředidla (R) R = 0,225 (využitelný objem pejety) x Pd - V

37 Postup ředění a plnění pejet
odebrané sperma ve sběrači do laboratoře, smyslové posouzení, zvážení do špičky sběrače keramický prútokový korálek, odběr vzorku pro stanovení hustoty zavaření sběrače, nasazení silikonové hadičky a korálek, připnutí na konec nálevky s ředidlem přidávání ředidla ke spermatu na oscilačním stolku, celk. doba ředění cca 10 min (býk), 45 min (kanec), laboratorní teplota do sběrače s naředěným spermatem nasávací hadičky  plnění do pejet automatické plnění: plnění, zatavení, označení, za hod 6-7 tis pejet

38 Označování pejet CS BJR 255 Bajer .. CZ 386 14964 020596 ISB CZ 04
1.oddíl: kód plemene (max 3 písmena) značka registru (max 3 písmena) číslo registru (max 3 číslice) 2. oddíl: jméno býka (max 24 písmen) IBR status (pozitivní IP, negativní volná místa) 3.oddíl: kód země číslo býka v uchu 4.oddíl: datum odběru spermatu 5. oddíl: kód inseminační stanice

39 Hluboké chlazení spermatu
kryobiologie = biologie nízkých teplot, chování biologických objektů při nízkých teplotách kryokonzervace = uchování bio materiálu při teplotách pod bodem mrazu kryoprotektiva = látky chránící biologický materiál zvyšují počet přežívajících buněk snížení množství ledových krystalů vliv na strukturu vody, zvyšují uspořádanost molekul v přírodě přežívají larvy až –30oC (glycerol dosahuje až 25% hmotnosti celé larvy) glycerol: pro kryokonzervaci pohl. buněk, krve, kostní dřeně přidaný ke spermatu váže volnou vodu zabraňuje krystalizaci důležitá je propustnost buněčné membrány nutné ponechat buňky v prostředí s glycerolem = ekvilibrace

40 Hluboké chlazení spermatu
dimethylsulfoxid: rychleji řřechází přes buněčnou membránu nevýhodou jsou toxické účinky suchý led: poprvé Polge a kol. (Anglie), 1949 ekvilibrace 3-5oC 4-16 hod, 16% glycerinu zmrazování na suchém ledu –79oC v peletách kontaminace směsí mikroorganismů tekutý dusík: Meryman (1966)  anabióza spermií při –130oC, pod –160oC jsou zastaveny rekrystalizační procesy tekutý dusík –196oC 1969 – 1972 zavedení japonské metody v ČR, snížení rizika kontaminace mykoplazmata: 60% ID kontaminováno (pelety), mycoplasma bovigenitalium při –160oC přežívají několik let, eliminace antibiotiky

41 Postup zmrazování spermatu
20% ejakulátů nevhodných ke zmrazování největší odumírání při 0 až –40oC, kritická teplota v kontejneru –60oC naplnění dutinek, ekvilibrace (= pronikání glycerolu přes cytoplazmatické membrány) průměrně 5 hod, nejméně však 2 hod zmrazování podle křivky řízené počítačem na roštu,páry tekutého dusíku, t -130oC, po vložení stoupne teplota na –70oC (kritická hranice) zmrazování po dobu 9 min  do tekutého dusíku

42 Uchování zmraženého spermatu
Dlouhodobě uchovávané sperma je sperma,které je po speciálním technologickém postupu uchováváno při teplotě –196oC ID v provozních kontejnerech v kelímcích po 24 až 48 hod. od zmražení hodnocení aktivita vyřazení spermatu s aktivitou nižší než 30% a když vyrobené množství pejet přesáhlo max. počet stanovení výpočtem pejety v kelímcích umístěny vatovou zátkou dole

43 Rozmrazování spermatu
rozmrazování bezprostředně před inseminací pejeta do vodní lázně, teplota cca 35oC pejety s obsahem 0,25 cm 3 7 vteřin pejety s obsahem 0,50 cm3 15 vteřin kontrola označení, vzduchová bublinka musí být u zavařeného konce pejety vložení do přenosové aparatury

44 Lyofilizace odstranění vody sublimací za zmrazeného stavu
1949 Polge – sperma kohouta (30% glycerolu) sperma se zmrazí a vysuší ve vakuu zabrání se hypertonickému prostředí získá se suchý prášek oživení spermií 5-20%