Prezentace se nahrává, počkejte prosím

Prezentace se nahrává, počkejte prosím

4. přednáška SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU.

Podobné prezentace


Prezentace na téma: "4. přednáška SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU."— Transkript prezentace:

1 4. přednáška SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU

2 Vývoj spermií - spermiogeneze Začíná v době pohlavní dospělosti Začíná v době pohlavní dospělosti V semenotvorných kanálcích varlat V semenotvorných kanálcích varlat Cyklicky se opakuje, jeden cyklus 40 – 70 dní Cyklicky se opakuje, jeden cyklus 40 – 70 dní Každý cyklus začíná o ¼ délky později Každý cyklus začíná o ¼ délky později Ve stěně kanálku 4 buňkové generace nad sebou Ve stěně kanálku 4 buňkové generace nad sebou Semenotvorné kanálky Semenotvorné kanálky zárodečný epitel s prvopohl. buňkami zárodečný epitel s prvopohl. buňkami Sertoliho podpůrné buňky Sertoliho podpůrné buňky

3 Spermiogeneze 1. Období rozmnožování (mitotické dělení) 2. Období růstu 3. Období zrání (meiotické dělení)  spermatocytogeneze  spermatocytogeneze 4. Období metamorfózy  spermatohistogeneze  spermatohistogeneze

4 Ad 1) Období rozmnožování Ad 1) Období rozmnožování  Opakované mitotické dělení původních kmenových buněk A – spermatogonií (primordiální gonocyty)  Rozdělení na dvě buňky:  Typ A: velké, mateřské zásobní buňky, latentní stádium  Typ I m : intermediární buňky, dále se dělí na:  Buňky typu B  další dělení  spermatocyty 1. řádu  spermatocyty 1. řádu

5 Ad 2) Období růstu Ad 2) Období růstu  Spermatocyty 1. řádu zvětšují svůj objem Ad 3) Období zrání Ad 3) Období zrání  Dvě po sobě jdoucí zrací dělení  Redukce počtu chromozomů na polovinu, rekombinace genetických vloh  Spermatocyty 1.řádu  dva spermatocyty 2.řádu  čtyři spermatidy  Poměr X a Y spermatid = 50:50

6 Ad 4) Období metamorfózy Ad 4) Období metamorfózy  Spermatida  spermie  Ve výběžcích Sertoliho buněk  Dílčí stádia: Golgiho, stadium akrozomové čepičky, stadium kaudální manžety, stadium zrání  Jádro se prodlouží a oploští  hlavička  Golgiho aparát  akrozom  Buněčné centrioly  krček a bičík  Uvolnění spermií do lumen semenotvorných kanálků a vývodných cest  Postup do ocasu nadvarlete cca 12 dní

7 Schéma spermatogeneze

8 Fáze spermatogeneze

9 Stavba varlete a nadvarlete býka

10 Denní produkce spermií Býk denně 2,5 x 10 9 spermií ( jeden gram testikulární tkáně vyprodukuje za 1 minutu 5- 10x10 3 spermií) Býk denně 2,5 x 10 9 spermií ( jeden gram testikulární tkáně vyprodukuje za 1 minutu 5- 10x10 3 spermií) Kanec denně 15x10 9, druhý rok až 31x10 9 Kanec denně 15x10 9, druhý rok až 31x10 9 Hřebec 6x10 9 spermií denně, rezerva až 20x10 9 Hřebec 6x10 9 spermií denně, rezerva až 20x10 9 U vyčerpaných nutná sexuální pauza 4-7 dní U vyčerpaných nutná sexuální pauza 4-7 dní

11 Rozměry spermií (mikrony) Celková délka Délka hlavičky Šířka hlavičky Býk Beran Kanec Hřebec Králík Drůbež ,5

12 Spermie různých druhů savců

13 Mikrostruktura spermie

14 Hlavička spermie: Hlavička spermie: 51% hmotnosti spermie 51% hmotnosti spermie Její úloha je přenést dědičný materiál v nukleoplazmě Její úloha je přenést dědičný materiál v nukleoplazmě Přední část kryta čepičkou – akrozomem Přední část kryta čepičkou – akrozomem Akrozom Akrozom Cytoplazmatický útvar, složen z mukopolysacharidů Cytoplazmatický útvar, složen z mukopolysacharidů Zaujímá 50% plochy hlavičky Zaujímá 50% plochy hlavičky Nositelem specifických enzymů (hyaluronidáza, akrozin, proakrozin, kyselá fosfatáza, proteináza aj.), které rozpouštějí zonu pellucidu a cytoplazmatický obal vajíčka Nositelem specifických enzymů (hyaluronidáza, akrozin, proakrozin, kyselá fosfatáza, proteináza aj.), které rozpouštějí zonu pellucidu a cytoplazmatický obal vajíčka Citlivost na osmotické změny vnějšího prostředí (bobtnání, oddělení) Citlivost na osmotické změny vnějšího prostředí (bobtnání, oddělení) Dobře barvitelný Dobře barvitelný

15 Mikrostruktura spermie Krček Krček Spojuje hlavičku s bičíkem, 2-3µm Spojuje hlavičku s bičíkem, 2-3µm Dva za sebou uložené centrioly, distální centriol obklopen devíti příčně segmentovanými provazci = chordami Dva za sebou uložené centrioly, distální centriol obklopen devíti příčně segmentovanými provazci = chordami Hlavice bičíku zapadá do implantační jamky, kloubové spojení Hlavice bičíku zapadá do implantační jamky, kloubové spojení Bičík Bičík Transport spermie Transport spermie Mitochondriální aparát – tvorba energie Mitochondriální aparát – tvorba energie Axiální vlákna – přeměna na mechanickou energii Axiální vlákna – přeměna na mechanickou energii Spojovací část bičíku:  Pokračováním krčku, ukončena distální centriolou  Osové vlákno – 9+2 fibril + chordy (hrubá vlákna)  Spirálovitá pochva – mitochondrie – respirační aparát

16 Mikrostruktura spermie Hlavní část bičíku: Hlavní část bičíku:  Tenčí než spojovací část  Podkladem je komplex vláken  Chordy tenčí, slepě končí  Osová vlákna obaluje fibrózní pochva – pevnost a pružnost pro kmitání Koncová část bičíku:  Osové vlákno není obaleno pochvou  Na povrchu cytoplazmatická membrána  Cytoplazmatická membrána  Pokrývá celou spermii, citlivá na změnu osm.tlaku  Velká permeabilita (látková výměna)  Rezistentní vůči kyselému prostředí  Nepropouští barvivo  metoda vitálně letálního barvení (rozlišení mrtvých a živých spermií)  Odumřením ustává permeabilita

17 Fyzikálně chemické vlastnosti spermatu Směs spermií a semenné plasmy Směs spermií a semenné plasmy Husté sperma: býk, beran, kozel Husté sperma: býk, beran, kozel Řídké sperma: hřebec, kanec Řídké sperma: hřebec, kanec Objem a hustota biologicky uzpůsobeny poměrům depozice do pohlavních orgánů – intravaginální x intracervikální Objem a hustota biologicky uzpůsobeny poměrům depozice do pohlavních orgánů – intravaginální x intracervikální

18 Parametry spermatu cm 3 Ø Sper. v mm 3 Ø Býk 2 – ,2 – 2,0x10 6 1,0x10 6 Beran 0,5 – 2 1 0,5 – 5,0x10 6 3,0x10 6 Hřebec 20 – ,03 – 0,8x10 6 0,12x10 6 Kanec 100 – ,05 – 0,5x10 6 0,25x10 6 Králík 0,4 – 2,0 1 0,05 – 0,5x10 6 0,25x10 6 Kohout 0,1 – 1,5 1 0,5 – 7,0x10 6 3,0x10 6 Krocan 0,2 – 1,0 0,5 3,0 – 7,0x10 6 4,0x10 6 Kačer 0,1 – 1,5 0,5 0,05 – 3,0x10 6 1,0x10 6 Houser 0,2 – 1,5 0,8 0,5 – 1,5x10 6 0,25x10 6 Muž 2,0 – 6,0 3,5 0,05 – 0,15x10 6 0,1x10 6

19 Životní projevy spermií Spotřeba energie – metabolické pochody Spotřeba energie – metabolické pochody Zdroj energie – fruktóza (glukóza), kys.mléčná Zdroj energie – fruktóza (glukóza), kys.mléčná Fruktolýza (glykolýza)  kyselina mléčná Fruktolýza (glykolýza)  kyselina mléčná Dýchání (respirace)  kys.mléčná do Krebsova cyklu Dýchání (respirace)  kys.mléčná do Krebsova cyklu Průběh metabolismu: Průběh metabolismu: V nadvarleti inaktivace: nižší teplota, pH 5,6 – 6,6, vyšší koncentrace CO 2, nedostatek fruktózy V nadvarleti inaktivace: nižší teplota, pH 5,6 – 6,6, vyšší koncentrace CO 2, nedostatek fruktózy V semenné plasmě (ředidle) a pohl. orgánech samice aktivace V semenné plasmě (ředidle) a pohl. orgánech samice aktivace

20 Životní projevy spermií GLYKOLÝZA GLYKOLÝZA Anaerobní (bez přístupu O 2 ) Anaerobní (bez přístupu O 2 ) Enzymy α a β-glukosidáza Enzymy α a β-glukosidáza Kys.mléčná – pokles pH Kys.mléčná – pokles pH Energie:  60% teplo, 40% pohyb Energie:  60% teplo, 40% pohyb Býk, beran, kozel Býk, beran, kozel C 6 H 12 O 6 +enzym  2CH 3. CHOH. COOH+E Glukóza,manóza,fruktóza,maltóza (disacharid) Glukóza,manóza,fruktóza,maltóza (disacharid) Hřebčí a kohoutí spermie využívají jen glukózu Hřebčí a kohoutí spermie využívají jen glukózu INDEX FRUKTOLÝZY = množství fruktózy spotřebované při 37 o C v anaerobních podmínkách za 1 hodinu na 10 9 spermií Býk 25mg, hřebec a kanec 0,2mg Býk 25mg, hřebec a kanec 0,2mg Přímo úměrný koncentraci a životnosti spermií Přímo úměrný koncentraci a životnosti spermií

21 Životní projevy spermií RESPIRACE RESPIRACE Aerobní metabolismus cukrů Aerobní metabolismus cukrů Přeměna kyseliny mléčné Přeměna kyseliny mléčné 19x účinnější: 40% teplo, 60% pohyb 19x účinnější: 40% teplo, 60% pohyb 0,3 ml O 2 na 10 9 spermií za 1 hodinu 0,3 ml O 2 na 10 9 spermií za 1 hodinu C 6 H 12 O 6 + 6O 2  6 CO H 2 O + E Beraní spermie vyčerpají fruktózu v ejakulátu za 15 min, další zdroj energie = fruktóza a kys. mléčná v sekretu pohl. ústrojí samice Beraní spermie vyčerpají fruktózu v ejakulátu za 15 min, další zdroj energie = fruktóza a kys. mléčná v sekretu pohl. ústrojí samice Respirace probíhá i v pohl. orgánech samice Respirace probíhá i v pohl. orgánech samice

22 Pohyb spermií V nadvarleti nepohyblivé V nadvarleti nepohyblivé Pohyb při styku se sekretem příd. pohl. žláz Pohyb při styku se sekretem příd. pohl. žláz Zralá a zdravá spermie má přímočarý progresivní pohyb vpřed za hlavičkou Zralá a zdravá spermie má přímočarý progresivní pohyb vpřed za hlavičkou Způsoby pohybu: Způsoby pohybu: Kmitáním bičíku Kmitáním bičíku Otáčivé pohyby kolem podélné osy Otáčivé pohyby kolem podélné osy Nejrychlejší pohyb v čerstvém spermatu Nejrychlejší pohyb v čerstvém spermatu Pohyb začíná od báze hlavičky a probíhá po celé délce bičíku Pohyb začíná od báze hlavičky a probíhá po celé délce bičíku 9 vln a 3-15 otoček za vteřinu 9 vln a 3-15 otoček za vteřinu

23 Pohyb spermií Hromadný pohyb: aktivní spermie rozvlní a uvedou do pohybu plasmu, která unáší spermie náhodným směrem Hromadný pohyb: aktivní spermie rozvlní a uvedou do pohybu plasmu, která unáší spermie náhodným směrem Centrum pohybu: v proximální centriole krčku Centrum pohybu: v proximální centriole krčku Směr pohybu: Směr pohybu: V ejakulátu nahodilým směrem V ejakulátu nahodilým směrem V pohl. orgánech reotaxe = schopnost pohybu proti proudu tekutiny V pohl. orgánech reotaxe = schopnost pohybu proti proudu tekutiny Rychlost spermií se zvyšuje s rychlostí proudící tekutiny, orientují se podle proudu Rychlost spermií se zvyšuje s rychlostí proudící tekutiny, orientují se podle proudu Nežádoucí pohyb: Nežádoucí pohyb: Krouživý (může být vydatný) Krouživý (může být vydatný) Otáčivý (kolem hlavičky) Otáčivý (kolem hlavičky) Vlnivý na místě Vlnivý na místě Zpětný Zpětný Aglutinace = shlukování spermií, ztráta záporného el. náboje (pokles pH, staré sperma) Aglutinace = shlukování spermií, ztráta záporného el. náboje (pokles pH, staré sperma)

24 Vlivy působící na aktivitu spermií Teplota Teplota Největší pohyb při o C Největší pohyb při o C Při 0 o C se pohyb zastavuje Při 0 o C se pohyb zastavuje Při 48 – 50 o C dochází ke koagulaci bílkovin optim. teplota pro uchovávání spermatu je 0-3 o C u býčích spermií kritická teplota 15 – 17 o C – dochází k tepelnému šoku při -1 až -17 o C dochází k intenzivní krystalizaci Při 48 – 50 o C dochází ke koagulaci bílkovin optim. teplota pro uchovávání spermatu je 0-3 o C u býčích spermií kritická teplota 15 – 17 o C – dochází k tepelnému šoku při -1 až -17 o C dochází k intenzivní krystalizaci pH pH Nejpříznivější 6,8 až 7,5 Nejpříznivější 6,8 až 7,5 Pod 6,0 a nad 8,0 spermie hynou Pod 6,0 a nad 8,0 spermie hynou Osmotický tlak – pouze izotonický Osmotický tlak – pouze izotonický Světlo – nepříznivě působí sluneční paprsky Světlo – nepříznivě působí sluneční paprsky

25 Rychlost transportu Prasnice Prasnice Spermie ve vejcovodu za 40 min. (průměrně 1-2 hod) Spermie ve vejcovodu za 40 min. (průměrně 1-2 hod) Krávy a ovce Krávy a ovce Spermie ve vejcovodu za 4 až 6 hodin Spermie ve vejcovodu za 4 až 6 hodin Průchod krčkem 30 min. Průchod krčkem 30 min. Průchod dělohou 2 hod. Průchod dělohou 2 hod. Průchod vejcovodem až 8 hod. Průchod vejcovodem až 8 hod. Při vaginální inseminaci zůstává 95% spermií ve vagíně Při vaginální inseminaci zůstává 95% spermií ve vagíně

26 Faktory ovlivňující transport spermií v pohlavním traktu samice Vnější pohlavní stimulace: Stahy svaloviny genitálního traktu Stahy svaloviny genitálního traktu Působení estrogenů Působení estrogenů Stimuly: Stimuly: Přítomnost samce, doteky mulcem, vzeskoky Přítomnost samce, doteky mulcem, vzeskoky Masáž vulvy, klitorisu, krčku Masáž vulvy, klitorisu, krčku Zavedení katetru Zavedení katetru Aplikace oxytocinu, PGF 2 α Aplikace oxytocinu, PGF 2 α U prasnice tlak na bedra U prasnice tlak na bedra Objem zavedené tekutiny Objem zavedené tekutiny Stres: faktor strachu – adrenalin  snižování aktivity dělohy, zpomalení transportu Stres: faktor strachu – adrenalin  snižování aktivity dělohy, zpomalení transportu

27 Faktory ovlivňující transport spermií v pohlavním traktu samice Objem a koncentrace spermií v ID: Norma : skot 10 – 12x10 6 spermií Norma : skot 10 – 12x10 6 spermií prasata 1,5x10 9 spermií prasata 1,5x10 9 spermií Pokusy s počtem spermií v ID Pokusy s počtem spermií v ID U skotu se nesnížila plodnost při 9 – 14 x 10 6 sperm. U skotu se nesnížila plodnost při 9 – 14 x 10 6 sperm. U prasat 1 – 5 x 10 9 sperm. U prasat 1 – 5 x 10 9 sperm. Selekce spermií na úrovni uterotubálního spojení Do vejcovodů přicházejí živé i mrtvé spermie Do vejcovodů přicházejí živé i mrtvé spermie Semenná plasma Obsahuje PGF 2 α  kontrakce (kanec cca 1ng PGF 2 α v 1ml ) Obsahuje PGF 2 α  kontrakce (kanec cca 1ng PGF 2 α v 1ml ) Při ředění se obsah PGF 2 α snižuje (opt. 1:15) Při ředění se obsah PGF 2 α snižuje (opt. 1:15)

28 Semenná plazma Prostředí pro spermie (výživa, pohyb) Prostředí pro spermie (výživa, pohyb) Ochrana proti nepříznivým vlivům Ochrana proti nepříznivým vlivům Výměšky nadvarlat, Cowperových žláz, prostaty, semenných váčků, uretrálních žláz, ampulí chámovodu Výměšky nadvarlat, Cowperových žláz, prostaty, semenných váčků, uretrálních žláz, ampulí chámovodu Výměšek nadvarlat: Výměšek nadvarlat: Bílkoviny, lipidy, K, Na Bílkoviny, lipidy, K, Na pH 5,6 – 6,6, dlouho přežívají spermie pH 5,6 – 6,6, dlouho přežívají spermie Cowperovy žlázy Cowperovy žlázy U kance 200ml (15-18%) U kance 200ml (15-18%) Odchází na začátku – zvlhčuje cesty Odchází na začátku – zvlhčuje cesty U kance po spermiích – hustý, naplňuje děl. krček,tvoří zátku U kance po spermiích – hustý, naplňuje děl. krček,tvoří zátku Ampule chámovodu Ampule chámovodu u býka sekret s vysokou hladinou fruktózy a kys. citronové, Ca,Na,K u býka sekret s vysokou hladinou fruktózy a kys. citronové, Ca,Na,K

29 Semenná plazma Semenné váčky: Semenné váčky: Bílkoviny, fruktóza, kys. citrónová Bílkoviny, fruktóza, kys. citrónová pH 5,7 – 6,2 pH 5,7 – 6,2 U býka 40 – 60%, u kance 20 – 25% U býka 40 – 60%, u kance 20 – 25% Na konci ejakulace, zdroj energie Na konci ejakulace, zdroj energie Prostata: Prostata: pH 6,5 – 8,0 pH 6,5 – 8,0 Upravuje reakci močové roury Upravuje reakci močové roury adrenalin,prostaglandin – ovlivnění děložních kontrakcí adrenalin,prostaglandin – ovlivnění děložních kontrakcí Specifický zápach Specifický zápach Uretrální žlázy: Uretrální žlázy: První frakce už při erekci První frakce už při erekci pH 8,0, šedobílá barva, 1-5ml. pH 8,0, šedobílá barva, 1-5ml.

30 Podíl semenné plasmy býk 80 – 85% beran 70 – 75% kanec 93 – 95% hřebec 90 – 95%

31 Vlastnosti semenné plasmy Osmotický tlak: Osmotický tlak: Isotonie = rovnováha Isotonie = rovnováha Hypotonický roztok: bičík se spirálovitě stáčí, spermie bobtnají Hypotonický roztok: bičík se spirálovitě stáčí, spermie bobtnají Hypertonický roztok: plasmolýza, spermie se svrašťují, bičík se skládá jako pila Hypertonický roztok: plasmolýza, spermie se svrašťují, bičík se skládá jako pila Koncentrace vodíkových iontů: Koncentrace vodíkových iontů: U čerstvého spermatu pH kolem 7,0 U čerstvého spermatu pH kolem 7,0 Při fruktolýze  kys. mléčná, pH klesá Při fruktolýze  kys. mléčná, pH klesá pH 6,0 – anabioza, pH 5,5 – 5,0 odumření spermie pH 6,0 – anabioza, pH 5,5 – 5,0 odumření spermie Plasma býka pH 6,6 – 6,8 Plasma býka pH 6,6 – 6,8 kance pH průměrně 7,0 kance pH průměrně 7,0 hřebce pH průměrně 7,5 hřebce pH průměrně 7,5 berana pH průměrně 7,0 berana pH průměrně 7,0

32 Zásady ředění a uchování spermatu cílem je uchovat oplozovací schopnost spermií in vitro cílem je uchovat oplozovací schopnost spermií in vitro ředění spermatu: větší objem, přežití spermií in vitro  uchování vitality a fertility, jen za stavu anabiózy ředění spermatu: větší objem, přežití spermií in vitro  uchování vitality a fertility, jen za stavu anabiózy konzervační roztok: konzervační roztok: stejné fyzikálně – chemické vlastnosti stejné fyzikálně – chemické vlastnosti chrání spermie před produkty metabolismu chrání spermie před produkty metabolismu zabraňuje chladovému šoku zabraňuje chladovému šoku

33 Komponenty používaných ředidel vaječný žloutek: vaječný žloutek: obsahuje výživné látky, ochranné koloidy obsahuje výživné látky, ochranné koloidy zvyšuje odolnost spermií proti chladovému šoku zvyšuje odolnost spermií proti chladovému šoku pufrovací schopnost, antikoagulační účinek pufrovací schopnost, antikoagulační účinek nevýhoda: živná půda pro zárodky  používání pouze čerstvých vajec (max 10 dnů stáří) od slepic z chovů prostých nákaz nevýhoda: živná půda pro zárodky  používání pouze čerstvých vajec (max 10 dnů stáří) od slepic z chovů prostých nákaz mléko: mléko: pufrovací roztok, zabraňuje aglutinaci pufrovací roztok, zabraňuje aglutinaci snižuje nebezpečí chladového šoku snižuje nebezpečí chladového šoku používá se plnotučné, odstředěné, homogenizované, laktóza používá se plnotučné, odstředěné, homogenizované, laktóza kryoprotektiva: kryoprotektiva: zabránění chladovému šoku zabránění chladovému šoku glycerin glycerin výživné látky: výživné látky: fruktoza, laktoza, kys. citronová fruktoza, laktoza, kys. citronová antibiotika: antibiotika: streptomycin, penicilin, linkomycin, spektinomycin streptomycin, penicilin, linkomycin, spektinomycin po přidání antibiotik ponechat min 45 min při 5 o C po přidání antibiotik ponechat min 45 min při 5 o C

34 Ředidla pro krátkodobé uchování žloutko-citrátové: žloutek+citronan sodný žloutko-citrátové: žloutek+citronan sodný žloutko-mléčné: žloutek+mléko žloutko-mléčné: žloutek+mléko ředidlo ze sušeného mléka: Sunar+ destilovaná voda ředidlo ze sušeného mléka: Sunar+ destilovaná voda Kare I, II: EDTA, pro kančí sperma Kare I, II: EDTA, pro kančí sperma

35 Ředidla pro dlouhodobé uchování TRILADYL TRILADYL komerční ředidlo dodávané v koncentrované formě komerční ředidlo dodávané v koncentrované formě dest. voda, glycerol, kys.citronová, fruktoza, antibiotika dest. voda, glycerol, kys.citronová, fruktoza, antibiotika do koncentrátu destilovaná voda + vaječný žloutek, zahřátí na 30 o C do koncentrátu destilovaná voda + vaječný žloutek, zahřátí na 30 o C LAKTÓZOVÉ ŘEDIDLO LAKTÓZOVÉ ŘEDIDLO 11% vodný roztok laktózy, vaječný žloutek, glycerin 11% vodný roztok laktózy, vaječný žloutek, glycerin míchání ve sterilním prostředí, přidávání antibiotik míchání ve sterilním prostředí, přidávání antibiotik TRIS TRIS destilovaná voda, tris, kys.citrónová, fruktóza, antibiotika destilovaná voda, tris, kys.citrónová, fruktóza, antibiotika TRIS = hydroxymethyl - aminometan TRIS = hydroxymethyl - aminometan přidání žloutku + glycerinu přidání žloutku + glycerinu Další komerční ředidla: Další komerční ředidla: příprava podle pokynů výrobce příprava podle pokynů výrobce

36 Stanovení stupně ředění předpoklad: inseminační dávka musí osahovat min 10mil aktivních spermií (Ps) předpoklad: inseminační dávka musí osahovat min 10mil aktivních spermií (Ps) základní hodnoty pro stanovení poměru ředění: základní hodnoty pro stanovení poměru ředění: hustota spermatu po odběru v miliardách (H) – 1100 mil v cm 3 hustota spermatu po odběru v miliardách (H) – 1100 mil v cm 3 procento aktivních spermií po rozmrazení (A) – 30% procento aktivních spermií po rozmrazení (A) – 30% objem ejakulátu (V) – 5 cm 3 objem ejakulátu (V) – 5 cm 3 praktický výpočet: praktický výpočet: objem pejety 0,250 cm 3 objem pejety 0,250 cm 3 využitelný objem (ztráta na zátku,vzduch.bublinu) 0,225 cm 3 využitelný objem (ztráta na zátku,vzduch.bublinu) 0,225 cm 3 při inseminaci se využije 0,190 cm 3  ztráta 15% při inseminaci se využije 0,190 cm 3  ztráta 15% aby se do plemenice dostalo min 10mil Ps, musí celá dávka obsahovat 12 mil Ps aby se do plemenice dostalo min 10mil Ps, musí celá dávka obsahovat 12 mil Ps vzorec pro výpočet počtu dávek (Pd): vzorec pro výpočet počtu dávek (Pd): Pd = (V x H x A) / Ps Pd = (V x H x A) / Ps vzorec pro výpočet množství přidávaného ředidla (R) vzorec pro výpočet množství přidávaného ředidla (R) R = 0,225 (využitelný objem pejety) x Pd - V R = 0,225 (využitelný objem pejety) x Pd - V

37 Postup ředění a plnění pejet odebrané sperma ve sběrači do laboratoře, smyslové posouzení, zvážení odebrané sperma ve sběrači do laboratoře, smyslové posouzení, zvážení do špičky sběrače keramický prútokový korálek, odběr vzorku pro stanovení hustoty do špičky sběrače keramický prútokový korálek, odběr vzorku pro stanovení hustoty zavaření sběrače, nasazení silikonové hadičky a korálek, připnutí na konec nálevky s ředidlem zavaření sběrače, nasazení silikonové hadičky a korálek, připnutí na konec nálevky s ředidlem přidávání ředidla ke spermatu na oscilačním stolku, celk. doba ředění cca 10 min (býk), 45 min (kanec), laboratorní teplota přidávání ředidla ke spermatu na oscilačním stolku, celk. doba ředění cca 10 min (býk), 45 min (kanec), laboratorní teplota do sběrače s naředěným spermatem nasávací hadičky  plnění do pejet do sběrače s naředěným spermatem nasávací hadičky  plnění do pejet automatické plnění: plnění, zatavení, označení, za hod 6- 7 tis pejet automatické plnění: plnění, zatavení, označení, za hod 6- 7 tis pejet

38 Označování pejet CS BJR 255 Bajer.. CZ ISB CZ 04 1.oddíl: kód plemene (max 3 písmena) kód plemene (max 3 písmena) značka registru (max 3 písmena) značka registru (max 3 písmena) číslo registru (max 3 číslice) číslo registru (max 3 číslice) 2. oddíl: jméno býka (max 24 písmen) jméno býka (max 24 písmen) IBR status (pozitivní IP, negativní volná místa) IBR status (pozitivní IP, negativní volná místa)3.oddíl: kód země kód země číslo býka v uchu číslo býka v uchu4.oddíl: datum odběru spermatu datum odběru spermatu 5. oddíl: kód inseminační stanice kód inseminační stanice

39 Hluboké chlazení spermatu kryobiologie = biologie nízkých teplot, chování biologických objektů při nízkých teplotách kryobiologie = biologie nízkých teplot, chování biologických objektů při nízkých teplotách kryokonzervace = uchování bio materiálu při teplotách pod bodem mrazu kryokonzervace = uchování bio materiálu při teplotách pod bodem mrazu kryoprotektiva = látky chránící biologický materiál kryoprotektiva = látky chránící biologický materiál zvyšují počet přežívajících buněk zvyšují počet přežívajících buněk snížení množství ledových krystalů snížení množství ledových krystalů vliv na strukturu vody, zvyšují uspořádanost molekul vliv na strukturu vody, zvyšují uspořádanost molekul v přírodě přežívají larvy až –30 o C (glycerol dosahuje až 25% hmotnosti celé larvy) v přírodě přežívají larvy až –30 o C (glycerol dosahuje až 25% hmotnosti celé larvy) glycerol: pro kryokonzervaci pohl. buněk, krve, kostní dřeně glycerol: pro kryokonzervaci pohl. buněk, krve, kostní dřeně přidaný ke spermatu váže volnou vodu přidaný ke spermatu váže volnou vodu zabraňuje krystalizaci zabraňuje krystalizaci důležitá je propustnost buněčné membrány důležitá je propustnost buněčné membrány nutné ponechat buňky v prostředí s glycerolem = ekvilibrace nutné ponechat buňky v prostředí s glycerolem = ekvilibrace

40 Hluboké chlazení spermatu dimethylsulfoxid: dimethylsulfoxid: rychleji řřechází přes buněčnou membránu rychleji řřechází přes buněčnou membránu nevýhodou jsou toxické účinky nevýhodou jsou toxické účinky suchý led: suchý led: poprvé Polge a kol. (Anglie), 1949 poprvé Polge a kol. (Anglie), 1949 ekvilibrace 3-5 o C 4-16 hod, 16% glycerinu ekvilibrace 3-5 o C 4-16 hod, 16% glycerinu zmrazování na suchém ledu –79 o C v peletách zmrazování na suchém ledu –79 o C v peletách kontaminace směsí mikroorganismů kontaminace směsí mikroorganismů tekutý dusík: tekutý dusík: Meryman (1966)  anabióza spermií při –130 o C, pod –160 o C jsou zastaveny rekrystalizační procesy Meryman (1966)  anabióza spermií při –130 o C, pod –160 o C jsou zastaveny rekrystalizační procesy tekutý dusík –196 o C tekutý dusík –196 o C 1969 – 1972 zavedení japonské metody v ČR, snížení rizika kontaminace 1969 – 1972 zavedení japonské metody v ČR, snížení rizika kontaminace mykoplazmata: mykoplazmata: 60% ID kontaminováno (pelety), mycoplasma bovigenitalium 60% ID kontaminováno (pelety), mycoplasma bovigenitalium při –160 o C přežívají několik let, eliminace antibiotiky při –160 o C přežívají několik let, eliminace antibiotiky

41 Postup zmrazování spermatu 20% ejakulátů nevhodných ke zmrazování 20% ejakulátů nevhodných ke zmrazování největší odumírání při 0 až –40 o C, kritická teplota v kontejneru –60 o C největší odumírání při 0 až –40 o C, kritická teplota v kontejneru –60 o C naplnění dutinek, ekvilibrace (= pronikání glycerolu přes cytoplazmatické membrány) průměrně 5 hod, nejméně však 2 hod naplnění dutinek, ekvilibrace (= pronikání glycerolu přes cytoplazmatické membrány) průměrně 5 hod, nejméně však 2 hod zmrazování podle křivky řízené počítačem zmrazování podle křivky řízené počítačem na roštu,páry tekutého dusíku, t -130 o C, po vložení stoupne teplota na –70 o C (kritická hranice) na roštu,páry tekutého dusíku, t -130 o C, po vložení stoupne teplota na –70 o C (kritická hranice) zmrazování po dobu 9 min  do tekutého dusíku zmrazování po dobu 9 min  do tekutého dusíku

42 Uchování zmraženého spermatu Dlouhodobě uchovávané sperma je sperma,které je po speciálním technologickém postupu uchováváno při teplotě –196 o C ID v provozních kontejnerech v kelímcích ID v provozních kontejnerech v kelímcích po 24 až 48 hod. od zmražení hodnocení aktivita po 24 až 48 hod. od zmražení hodnocení aktivita vyřazení spermatu s aktivitou nižší než 30% a když vyrobené množství pejet přesáhlo max. počet stanovení výpočtem vyřazení spermatu s aktivitou nižší než 30% a když vyrobené množství pejet přesáhlo max. počet stanovení výpočtem pejety v kelímcích umístěny vatovou zátkou dole pejety v kelímcích umístěny vatovou zátkou dole

43 Rozmrazování spermatu rozmrazování bezprostředně před inseminací rozmrazování bezprostředně před inseminací pejeta do vodní lázně, teplota cca 35 o C pejeta do vodní lázně, teplota cca 35 o C pejety s obsahem 0,25 cm 3 7 vteřin pejety s obsahem 0,25 cm 3 7 vteřin pejety s obsahem 0,50 cm 3 15 vteřin pejety s obsahem 0,50 cm 3 15 vteřin kontrola označení, vzduchová bublinka musí být u zavařeného konce pejety kontrola označení, vzduchová bublinka musí být u zavařeného konce pejety vložení do přenosové aparatury vložení do přenosové aparatury

44 Lyofilizace odstranění vody sublimací za zmrazeného stavu odstranění vody sublimací za zmrazeného stavu 1949 Polge – sperma kohouta (30% glycerolu) 1949 Polge – sperma kohouta (30% glycerolu) sperma se zmrazí a vysuší ve vakuu sperma se zmrazí a vysuší ve vakuu zabrání se hypertonickému prostředí zabrání se hypertonickému prostředí získá se suchý prášek získá se suchý prášek oživení spermií 5-20% oživení spermií 5-20%


Stáhnout ppt "4. přednáška SPERMIOGENEZE, SLOŽENÍ A KVALITA SPERMATU ZÁSADY UCHOVÁNÍ SPERMATU."

Podobné prezentace


Reklamy Google