Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy

Prezentace na téma: "Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy"— Transkript prezentace:

1 Fluorescenční a fotoaktivovatelné sondy
Jaroslava Hniličková

2 Co jsou to fluorescenční metody, možnosti jejich použití
Vlastní a nevlastní fluorescence Fluorescenční značky Fluorescenční sondy Příklady použití fluorescenčních sond

3 Fluorescence Fluorescence - schopnost některých látek po ozáření - excitaci světlem určité vlnové délky vyzařovat - emitovat světlo jiné vlnové délky Stokesův posun Rozdíl vlnových délek absorpčního (excitačního) a emisního maxima Emitované záření má větší vlnovou délku (nižší energii)

4 Fluorescenční metody, možnosti použití
Využití fluorescence Biochemický a biofyzikální výzkum Enzymové reakce, transport membránou, přenos signálu, studium neurotransmiterových receptorů a iontových kanálů, hledání vazebného místa v biomolekule Klinická chemie Genetické analýzy, genetické manipulace Analýza DNA Biomedicína Nahrazení metod využívajících radionuklidové zářiče Výhoda – možnost studia pochodů v živých buňkách

5 Výhody fotoafinitních sond
Afinitní sondy – nevýhody: možnost deaktivace, hydrolýzy ještě před navázáním na vazebné místo možnost interakce na jiném než vazebném místě Fotoaktivovatelná sonda: Chemicky inertní sonda chemicky reaktivní ozáření

6 Používané přístroje Přístroje: Fluorimetry Spektrofluorimetry
Fluorescenční skenery Fluorescenční mikroskopy Průtokové cytometry Princip přístrojů využívajících fluorescenci

7 excitační monochromátor
Měření fluorescence vzorek emisní monochromátor detektor zdroj excitační monochromátor čtecí zařízení Fluorimetr Jenway řady 6200

8 Fluorescenční mikroskopy
Fluorescenční mikroskop XFT 313 FL 2002 K – Fluorescenční mikroskop

9 Software Leica Application Suite Advance Fluorescence je modulární systém pro základní i profesionální práci s fluorescenčním obrazem.

10 Endotelové buňky pod mikroskopem
. Endotelové buňky pod mikroskopem Fluorescenční mikroskop se třemi kanály umožňuje zobrazení jednotlivých částí buňky (mitochondrie, cytoskelet, jádro)

11 Vlastní a nevlastní fluorescence
Vlastní fluorofory (vnitřní, intrinsic) vyskytují se přirozeně Proteiny (aromatické aminokyseliny, např. fenylalanin), vitamin A, cytochromy, hemoglobin, chlorofyl Nevlastní fluorofory (vnější, extrinsic) jsou přidány ke vzorkům, které nemají vhodné fluorescenční vlastnosti Použití nevlastních fluoroforů je mnohem častější než použití vlastních

12 Nevlastní fluoroscence
Fluorescenční značky látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží kovalentně fluorescenční značení proteinů Fluorescenční sondy látky přidané ke studovanému vzorku, které se váží nekovalentně Požadované vlastnosti specifická vazba na buněčné složky citlivost emise na změny v okolí podobnost s původní sloučeninou po zavedení fluoroforu nesmí dojít k narušení biologických systémů

13 Principy fotoafinitního značení
Biologicky aktivní Chemicky stálé bez přítomnosti světla – možnost skladování Stálé v podmínkách experimentu Krátký poločas – minimalizace nespecifického značení Vysoká specificita Snadná syntetická dostupnost Stálost aduktu v podmínkách použitých analytických technik (elektroforéza, hmotnostní spektrometrie)

14 Principy fotoafinitního značení
Fotoreaktivní skupina – modrá Radioizotop – červený Protein - zelený

15 Chemické struktury barev Alexa

16 Emisní spektra pro Alexa Fluor barevné serie

17 Alexa Fluor Cadaverine 647

18 Syntéza AFCS DCC: Dicyklohexylkarbodiimid, CMO.HCl: karboxymethyloxim hydrochlorid, NHS: N-Hydroxyskcinimid

19

20 Specifičnost absorpce AFCS
Absorpce fluoroforu AF647 minimální ve srovnání s absorpcí AFCS Snažší absorpce způsobena CS částí molekuly

21 Rychlá absorpce AFCS Šipky ukazují endosomy označené AFCS

22 Pohyb AFCS v buňkách Signál AFCS se rychle ztrácí z PM a akumuluje se ve vakuolách

23 Pohyb AFCS v buňkách AFCS je v PM, endozomech (označeno šipkami) a hromadí se ve vakuolách

24 AFCS putuje z PM do vakuol

25 Význam AFCS Vývoj bioaktivního fluorescenčně značeného brassinosteroidu BR Alexa Fluor 647 kastasteron (AFCS) umožňuje pozorování endocytózy komplexů BR1-ligandu v živých buňkách. Užitím různých endomembránových značek lze mapovat endocytickou cestu komplexu BRI1-AFCS z plasmatické membrány do vakuol.

26 Příprava steroidu pro navázání Alexy

27 Příprava steroidu pro navázání Alexy

28 Příprava aktivního esteru Alexy
ethyldiisopropylamine, (O-(N-succinimidyl)-1,1,3,3 tetramethyluronium tetrafluoroborate, H2O, DMF, 0 °C

29 Alexa navázaná na steroid

30

31 DHEA (1), Photo-DHEA (2), a DHEA-Bodipy (3)

32 Další fluorofory 7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol

33 BODIPY boron-dipyrromethene
Skupina fluorescenčních značek, jejichž fluorofor obsahuje bór Použití: značení proteinů, nukleotidů, enzymových substrátů, mastných kyselin, fosfolipidů boron-dipyrromethene 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene

34 Struktury BODIPY

35 Dansylchlorid DNS-Cl 5-dimethylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid
Reaguje s volnými aminoskupinami proteinů DNS-Cl 5-dimethylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid

36 Fluorescentní steroly pro studium pohybu cholesterolu v živých buňkách

37 Závěr Využití fluorescence – nedestruktivní způsob sledování a analýzy biologických molekul prosřednictvím fluorescenční emise o určité frekvenci. Existuje velká řada vnějších fluoroforů, takže je možnost výběru toho nejvhodnějšího. Přehled je možno nalézt na stránkách

38 Literatura Gimpl G. Gehrig-Burger K.: Probes for studying cholesterol binding and cell biology. Steroids 76 (2011) 216–231 Waschatko G. et al.: Photo-DHEA—A functional photoreactive dehydroepiandrosterone (DHEA) analog. Steroids, 76 (2011), Irani N. G. et al.: Fluorescent brassinosteroids trace the endocytic route of BRI1, k tisku Borovska J. et al.:. Neurosteroid access to the NMDA receptor, k tisku probes.com

39 Děkuji za pozornost