Metodická základna molekulární patologie

Prezentace na téma: "Metodická základna molekulární patologie"— Transkript prezentace:

1 Metodická základna molekulární patologie
Michala Fiurášková, Jan Bouchal, Zdeněk Kolář Laboratoř molekulární patologie LF UP Olomouc

2 Molekulární metody genová úroveň nemoci přesné stanovení diagnózy
infekční choroby onkologická onemocnění určení proliferační aktivity (imunohistochemické stanovení Ki67, PCNA) predispozice k chorobám-ateroskleróza, diabetes stanovení otcovství stanovení DNA ploidie - počítačová analýza, průtoková cytometrie) stanovení diferenciačních markerů (CD), onkoproteinů, onkofetálních antigenů (imunohistochemie, průtoková cytometrie) stanovení exprese receptorů pro růstové faktory (imunohistochemické: steroidní hormony, c-erbB-2…) somatické a germinální mutace

3 ÚVOD

4 Molekulární diagnostika
Zásadní roli hrají: Monoklonální protilátky Hybridizace PCR (polymerázová řetězová reakce)

5 Monoklonální protilátky
Imunohistochemie (téměř 200 protilátek na Ústavu patologie) Analýza proteinů v buněčných lyzátech (imunoblotting) ELISA test

6 afinita antigenu a specifické protilátky
Imunohistochemie aplikace imunologických metod při studiu tkání nebo buněk afinita antigenu a specifické protilátky

7 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)
„sandwich“ protilátka-antigen Kvantitativní analýza exprese proteinů Těhotenské testy Detekce infekčních agens

8 Western analýza=imunoblotting (proteiny)
kDa 220 97 66 45 30 20 elektroforéza (polyakrylamidový gel) nitrocelulózová membrána prim, sek. protilátka chemiluminiscence p53 bandy Bcl-XL

9 Southern-Northern blotting (DNA, RNA)
rozštěpení NK – restrikční endonukleáza elektroforéza detekce specifického fragmentu kapilárním přenosem a hybridizací

10 Metody založené na hybridizaci
arteficiální spojení dvou vláken DNA komplementarita bází, DNA sonda (próba) ISH (in situ hybridizace) FISH (fluorescenční ISH) SKY (spektrální karyotypování) mFISH (multi color FISH) CGH – komparativní genomová hybridizace DNA čipy

11 FISH fluorescenční in situ hybridizace
Možnost analýzy interfázních chromozomů (nevyžaduje kultivaci buněk a přípravu metafázických chromozomů) - Detekce polysomií, translokací, inverzí, delecí

12 SKY – spektrální karyotypování (spectral karyotyping)
- počítačové zobrazení a analýza cytogenetické laboratoře identifikace početních i strukturálních chromozomálních aberací

13 high resolution banding
mFISH Multi color FISH/ high resolution banding kombinace fluorochromů

14 CGH – komparativní genomová hybridizace (Comparative Genomic Hybridization)
vizualizace chromozomových poruch hybridizace

15 DNA čipy (microarray) izolace DNA hybridizace počítačové zpracování
Alterace DNA změněná exprese a aktivita proteinů DNA sekvence (array)

16 DNA čipy

17 DNA čipy - identifikace nových genů unikátní informace o změnách
v expresi celého genomu v odpovědi na pokusný zásah nové diagnostické markery (BRCA1, BRCA2-adenokarcinom mléčné žlázy nebo ovaria)

18 PCR – polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)
detekce abnormální funkce genu (onkogeny, viry, bakterie, paraziti) enzymatická syntéza a amplifikace specifických sekvencí NK primer

19 Využití PCR - detekce libovolných mutací - identifikace virů, bakterií, buněčných parazitů - RT-PCR (reverzní transkriptáza) –pro detekci mRNA

20 3SR amplifikační reakce (self-sustained sequence replication)
metoda detekující genové amplifikace využívá kolektivního účinku reverzní transkriptázy (např. z ptačího myeloblastového viru), RNázy H (z Escherichia coli) a T7 RNA polymerázy. přírodní replikační proces retrovirů realizovaný in vitro.

21 Přehled 1 Diagnostika Základní výzkum Terapie
Monoklonální protilátky (IHCH, elisa, imunoblotting) Hybridizace (FISH, CGH, DNA čipy) PCR detekční koncovka (fluorescenční, radioaktivní, barevná) Základní výzkum Terapie

22 Základní výzkum Snaha o pochopení životních pochodů a možnosti jejich ovlivnění Může vycházet z dat získaných při klinické práci Buněčné kultury ovlivňování chemickými látkami cílené zásahy do vnitřního prostředí buněk (antisense RNA, transientní nebo stabilní transfekce = zavádění cizích genů do buněk) studium proliferace, apoptózy, jednotlivých i globálních změn exprese genů (DNA čipy, WB, IHCH)

23 Základní výzkum In vivo na zvířatech (výsadní postavení myší)
athymické nahé myši pro studium nádorů knock-out/in myši (inaktivace/nový gen transgenní organismy) Průtoková cytometrie Tkáňová mikroarray Mikrodisekce mechanická laserová

24 Průtoková cytometrie technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic (např. buněk) v suspenzi cíleně separovat částice (buňky) splňující požadované parametry běžně užívané aplikace: detekce apoptózy analýza buněčného cyklu mnohobarevná imunofenotypizace buněčná proliferace

25 Tkáňová microarray (TMA)
1 parafinový blok – soubor různých tkání 0.2cm 0.06cm

26 Imunohistochemické barvení TMA
Lung MB H&E MNF-116 (total keratin) barvení

27 Mechanická mikrodisekce
separace buněk z tkáně

28 Laserová mikrodisekce (LCM)

29 Restrikční endonukleázy
enzymy– vyštěpení určitých úseků DNA Molekulární klonování (plasmidy = extrachromozomální kruhové molekuly DNA - DNA knihovna (soubor sekvencí lidské DNA, DNA inzert) - cDNA knihovna (přepis mRNA) Sekvenování - lineární sekvence nukleotidů

30 Projekt HUGO (Human Genome Mapping Organization)
složení lidského genomu 30-40 tisíc genů (jen 2x více než háďátko nebo octomilka) pouze 3-5% celého genomu jsou sekvence překládané do proteinů 95% genomu představují repetice-nekódující sekvence

31 Přehled 2 Diagnostika Základní výzkum Terapie Monoklonální protilátky
Hybridizace PCR Základní výzkum Buněčné kultury + DNA manipulace Zvířecí modely Tkáňová mikroarray mikrodisekce Terapie

32 Terapie Získání léku na základě poznání biologického procesu, na základě screeningu chemických knihoven Klinické testy Genová terapie

33 Amplifikace HER2-NEU u nádorů prsu
Imunohistochemické vyšetření + FISH Her2 = receptor z rodiny epidermálních růstových faktorů, gen amplifikován u 25-30% karcinomu mléčné žlázy Indikace léčby„herceptinem“ (blokace receptoru) Vyšetření 6 tis. x roční léčba 1 mil Kč (červeně HER2, modře centromera 17, zeleně TOPO2a)

34 Genová Terapie -Přenos genetického materiálu, jenž má léčebný účinek
-Cílené vyřazení aberantního proteinu (např.onkogenu u rakoviny) Obnova exprese mutovaného genu u dědičných chorob Problém obranných mechanismů buňky k cizorodé DNA Problém selektivní terapie defektních buněk

35 Genová Terapie („antisense“ technologie)
Antisense RNA – RNA komplementární k určité mRNA komplex translace umlčení genu

36 Shrnutí Diagnostika Monoklonální protilátky Hybridizace PCR
Základní výzkum Buněčné kultury + DNA manipulace Zvířecí modely Tkáňová mikroarray mikrodisekce Terapie snaha o zacílení na molekulární úrovni