Metody v histologii Mikroskop.

Prezentace na téma: "Metody v histologii Mikroskop."— Transkript prezentace:

1 Metody v histologii Mikroskop

2 Organizace praktických cvičení
Příprava histologického preparátu Mikroskop Barvicí metody Práce s mikroskopem (preparáty)

3 Zobrazení živých buněk
Jednobuněčné organismy Mnohobuněčné organismy: gamety, krvinky, buňky z tkáňových kultur Pozorování buď speciálním mikroskopem (fázový kontrast) nebo po barvení supravitálními barvivy

4 Odběr Odběr tkání a buněk: Ze živého organismu (BIOPSIE)
Z mrtvoly (NEKROPSIE) Je nutno provést fixaci, jinak se tkáň vlivem vlastních enzymů a působením bakterií rozloží (AUTOLÝZA) Blok tkáně pro fixaci ve světelné mikroskopii nemá být větší než 1cm3

5 Fixace Fixace zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením nebo denaturací enzymů. Fyzikální metody: Teplo (mikrovlnná trouba) Zmražení (tekutý dusík – 170 oC) Chemické metody: Imerzní (ponoření do fixační tekutiny) Perfuzní (nástřik cév)

6 Chemická fixace Aldehydy Formaldehyd, glutaraldehyd Alkoholy
Methanol, ethanol Kyseliny Kyselina octová, trichloroctová, pikrová Soli těžkých kovů Chlorid rtuťnatý, oxid osmičelý,dvojchroman draselný

7 Fixační tekutiny Formaldehyd 4% Bouinova tekutina
trinitrofenol, formol, kys.octová Susa chlorid rtuťnatý, chlorid sodný, kys.octová, kys.trichloroctová, formol Zenkerova tekutina chlorid rtuťnatý, dvojchroman draselný,síran sodný, kys. octová Carnoy ethanol, chloroform, kys.octová Methacarn Methanol, chloroform, kys.octová

8 Zalévání a krájení Pro krájení je nutno tkáň zpevnit zalitím do zalévacích médií (parafin, celloidin). Protože tato media nejsou mísitelná s vodou, je nutno vodu z tkání odstranit vzestupnou řadou alkoholů (odvodnění) a poté prosytit rozpouštědlem zalévacího media (xylen, toluen, aceton), který tkáň „projasní“.

9 Zalévání V malém množství se tkáň prosycuje parafinem v kádinkách v termostatu Pro provoz na patologii slouží přístroje na automatické zalévání

10 Krájení Tkáň je třeba nakrájet na řezy o tloušťce jedné vrstvy buněk, tedy 4-10mm. Tkáň je pak průhledná a „dobře čitelná“ Přístroje, které se k tomu užívají se jmenují mikrotomy. Nakrájené řezy se dávají na podložní sklo, kde se teplem natáhnou. K přilepení se používá bílek-glycerin

11 Mikrotom

12 Barvení Umožňuje rozlišení jednotlivých součástí buněk a tkání.
Barviva jsou rozpustná ve vodě, proto je třeba z řezu odstranit parafin. Po obarvení se řez montuje do pryskyřic. Tak vzniká trvalý preparát, který se prohlíží v mikroskopu.

13 Barvení Z řezů je třeba odstranit parafin a znovu je zavodnit, aby bylo možno tkáně barvit. Většina barviv je rozpustných ve vodě.

14 Trvalý preparát Po obarvení se z tkáně znovu odstraní voda
Trvalý preparát se připraví přilepením krycího skla pomocí kanadského balzámu ( má stejný lom světla jako sklo) nebo umělých pryskyřic Po zaschnutí vznikne TRVALÝ PREPARÁT

15 Postup Parafínové řezy Kryostatové řezy Fixace Zmražení při – 170 oC
Vypírání Odvodnění řadou alkoholů Prosycení rozpouštědlem Zalití do parafínu Krájení Krájení v kryostatu Nalepení řezů na podložní sklo Odparafínování a zavodnění Někdy krátká fixace Převedení do vody Barvení, histochemická reakce Zejména histochemické reakce Odvodnění a projasnění Někdy odvodnění a projasnění Montovací medium zpravidla bezvodé Bezvodé medium nebo glycerin -želatina

16 Mikroskop Stativ Optický systém: Mikrometrický šroub Okuláry Objektivy
Kondenzor Zdroj

17 Rozlišovací schopnost
Rozlišovací schopnost je nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, při které je ještě dovedeme rozlišit jako dva samostatné objekty. Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu je 0,2 mm.

18 Barvení Přehledná Selektivní Hematoxylin eosin Massonovy trichromy
Weigert van Gieson Heidenhainův železitý hematoxylin Selektivní Weigert resorcin fuchsin Impregnace stříbrem

19 Hematoxylin - eosin Hematoxylin barví kyselé součásti buňky (bazofilní struktury) – DNA, RNA, tj. jádro, jadérko, ribozomy a granulární endoplasmatické retikulum Eosin barví zásadité struktury buňky (acidofilní, eosinofilní) – což jsou hlavně proteiny, tj. cytoplasmu, mitochondrie, hladké endoplasmatické retikulum,a kolagen v mezibuněčné hmotě

20 Hematoxylin - eosin

21 AZAN Azokarmín barví jadra červeně
Anilínová modř barví kolagenní vlákna a mucin modře Oranž G barví cytoplasmu buněk a svaly oranžově Erytrocyty jsou červené

22 AZAN

23 Weigert – van Gieson Weigertův hematoxylin barví jádra šedě
Saturnová červeň (nebo kyselý fuchsin) barví kolagenní vlákna červeně Kyselina pikrová barví cytoplasmu buněk a svalovinu žlutě

24 Weigert van Gieson Nalepení řezů na podložní sklo

25 Weigert van Gieson

26 Hematoxylin - eosin

27 Weigert-van Gieson

28 Zelený Massonův trichrom
Hematoxylin barví jádra modře až černě Kyselý fuchsin barví svalovinu červeně Světlá zeleň barví kolagenní vlákna zeleně. Erytrocyty jsou červené

29 Zelený Massonův trichrom

30 AZAN

31 Žlutý Massonův trichrom
Hematoxylin barví jádra modře až černě Erythrosin barví svalovinu červeně Šafrán (Tuchechtgelb) barví kolagenní vlákna žlutě Erytrocyty jsou červené

32 Žlutý Massonův trichrom

33 Weigert resorcin - fuchsin
Resorcin fuchsin barví elastická vlákna fialově Selektivní barvení na elastiku

34 Weigert resorcin - fuchsin

35 Heidenhainův železitý hematoxylin
Heidenhainův železitý hematoxylin barví nejen jádra ale i cytoplasmu šedo-černě. Používá se pro barvení svalů a v parazitologii na průkaz parazitů (červů) v tkáních

36 Heidenhainův železitý hematoxylin

37 Heidenhainův železitý hematoxylin

38 Impregnace stříbrem Stříbro barví kolagenní a retikulární vlákna hnědě až černě. Impregnace stříbrem se používá i pro barvení neuronů a glie v neurohistologii.

39 Impregnace stříbrem

40 Kresylvioleť Kresyl violeť barví DNA a RNA v buňce fialově.
Znázorní tedy jádro, jadérko, granulární endoplasmatické retikulum (Nisslovu substanci) v neuronech

41 Kresylvioleť

42 Kresylvioleť

43 Výsledky barvicích metod
Barvení Barvivo Jádro Kolagen Elastika Svaly Poznámka Hematoxylin-eosin Hematoxylin Eosin modré až černé růžový růžové Weigert – van Gieson Weigertův hematoxylin Saturnová červeň Trinitrofenol hnědé červený žluté místo Saturnové červeni se používá také kyselý fuchsin, žluté -vše kromě kolagenu AZAN Azokarmín Anilínová modř Oranž G červené modrý oranžově červené červené - erytrocyty modrý - mucin Modrý Massonův trichrom Kyselý fuchsin Žlutý Massonův trichrom Erytrosin Šafrán žlutý červené – erytrocyty možno použít i kyselý fuchsin a Tuchecht gelb Zelený Massonův trichrom Světlá zeleň zelená Weigertův resorcin-fuchsin Resorcin Fuchsin fialová Impregnace Ag AgNO3 hnědý šedo-černé retikulární vlákna - černá Heidenhainův železitý hematoxylin HŽH Heidenhainův železitý hematoxylin hnědé až černé

44 Co je třeba umět? Co je to fixace? Proč a jak se dělá.
Jak se připraví preparát – přehled. Základní barvení. Jak se co obarví. Proč se používají různá barvení? Barvení hematoxylinem – eosinem. Rozlišovací schopnost světelného mikroskopu