J. Weiser Laboratoř mikrobiální proteomiky Proteomika jako nástroj ke studiu fyziologických regulací u bakterií.

Prezentace na téma: "J. Weiser Laboratoř mikrobiální proteomiky Proteomika jako nástroj ke studiu fyziologických regulací u bakterií."— Transkript prezentace:

1 J. Weiser (weiser@biomed.cas.cz) Laboratoř mikrobiální proteomiky Proteomika jako nástroj ke studiu fyziologických regulací u bakterií

2 acgtaagctagcttagc Bakteriální buňka Genom Proteomy Balancovaný růst Hladovění Stres Post-translační modifikace Od genomu k transkriptomům, proteomům a dalším -biomům Transkriptomy ? Metabolomy

3 Dělení směsí proteinů Technologie studia proteomů příprava vzorků 2D elektroforéza Obrazová analýza gelů Expresní profily Statistická analýza dat Modelování regulačních sítí Identifikace proteinů LC-MS-MS a jiné vícerozměrné chromatografické metody Identifikace proteinů ICAT SILAC 18 O labelling Expresní profily Identifikace proteinů

4 - Streptomyces noursei, barveno stříbrem SDS (M r ) IEF (pI) pH 3 pH 10 kyselé bazické Velké 100 kD 10 KD malé Vysokorozlišovací 2D elektroforéza proteinů IEF + ++ + - - -- - -- - - - - - - - - + Trubičkový gel IPG proužek

5 Antibiotika producenti – resistence Streptomycety - Escherichia coli primární metabolizmus sekundární metabolizmus Simulace přirozeného životního prostředí kultivace na skleněných kuličkách kontinuální kultivace

6 Sample preparation and processing life cycle entry life cycle exit sample processing myceliumspores cell disintegration grinding in mortar bead beater extraction sample analysis

7 Biosyntetická dráha chlortetracyklinu - nové poznatky 1 5 10 15 20 25 S.aureofaciens MYTFINRFTVTGDVAEFETLVGEIS S.rimosus VTFINRFTVQGDAAEFEKRVGEIT 26 30 35 EFMSGRPGFR AHMSRQPGFR 13Ka 13Kb Tetracyklin dehydrogenáza 2 izoformy N-terminální sekvence analog u S.rimosus Anhydrotetracyklin monooxygenáza - 4 izoformy a jejich expresní profily Pokroky v Mikrobiologii MBÚ 2006

8 Kinetika exprese vybraných proteinů podílejících se na biosyntéze chlortetracyklinu Mycelium S. aureofaciens vyrostlé v chlortetracyklin produkčním mediu bylo pulzně značeno 35 S-metioninem. Grafy znázorňují relativní rychlosti syntézy jednotlivých proteinů vyjádřené jako poměr jejich koncentrace ke koncentraci EF-Tu v daném čase kultivace.

9 ppk - SCHEME OF THE WORK 48, 72 h Antibiotic production Morphology (SEM) 0, 15, 20, 25, 48, 72 h 1 Protein analysis (1D el) Protein analysis (2D el) ATP levels (luciferin-luciferase method) Antibiotic level analysis (TLC) 15, 20, 25, 48, 72 h 15, 25, 50, 72 h 2 15, 20, 25, 48, 72 h Protein labeling with 35 S methionin 50, 72 h

10 SET OF SELECTED PROTEINS ON 2D GELS WITH STAINED AND RADIOACTIVELY LABELED PROTEINS 72 h ppk - 72 h wt 50 h wt50 h ppk - 49-51 h wt 49-51 h ppk - 71-73 h wt 71-73 h ppk - 1 2 3 6 4 5

11 Experimentální strategie - studium adaptivních mutací Kultivační profil  Vzorky o Resistence k erytromycinu o Zdatnost - Růstové křivky, doba zdvojení, velikost kolonií, CFU - Přesnost translace - Celková rychlost translace - Tu/proteiny celkem o 2D-elektroforéza - analýza proteinových profilů - MS identifikace proteinů

12 43 h 68 h 77 h103 h 43h 68h 77h 103h Proteinové profily u vybraných vzorků z kontrolního experimentu