Vysokorozlišovací detekce mutací a polymorfismů na základě DNA denaturační analýzy s použitím kapilárního sekvenátoru M. Minárik, L. Fantová, R. Chudoba.

Prezentace na téma: "Vysokorozlišovací detekce mutací a polymorfismů na základě DNA denaturační analýzy s použitím kapilárního sekvenátoru M. Minárik, L. Fantová, R. Chudoba."— Transkript prezentace:

1 Vysokorozlišovací detekce mutací a polymorfismů na základě DNA denaturační analýzy s použitím kapilárního sekvenátoru M. Minárik, L. Fantová, R. Chudoba , L. Benešová Laboratoř molekulární genetiky a onkologie Genomac International

2 Capillary Electrophoresis
1981 Jim Jorgenson - capillary zone electrophoresis (CZE) 1990 Beckman Instruments - first CE system with fluorescence detection 1996 Molecular Dynamics - first commercial capillary array system (CAE) 1998 Celera Genomics (Craig Venter) - high throughput sequencing by CAE 2000 Human Genome Project + Celera Genomics - draft genome sequence

3 Princip formování heteroduplexů
(většinou součástí PCR programu) Denaturace Zchlazení + + 95°C 5min Wt Mt ssDNA Heteroduplexy Homoduplexy

4 (CE separace za podmínek částečné denaturace)
Princip separace (CE separace za podmínek částečné denaturace) Teplota Teplota

5 Denaturant Gradient Gel electrophoresis (DGGE)
Fischer, S.G. and L.S. Lerman, Proc Natl Acad Sci, 1983, 80,

6 Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE)
Heteroduplexes Homoduplexes Riesner et al. Electrophoresis, 1989, 10,

7 Denaturing Capillary Electrophoresis
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 MUT-HET MUT-HOMO WT Time (min) LIF (488 nm / 520 nm) Khrapko et al. Nucleic Acids Res 1994, 22,

8 Denaturing Capillary Electrophoresis
(labelled) primer with GC-clamp Genomic DNA standard primer 200 bp product

9 Profil 2 mutací v exonu 8 genu TP53
40 50 60 70 80 90 HET1-HET2 WT-HET2 WT-HET1 HOMO2 HOMO1 WT LIF (488 nm / 520 nm) Time (min)

10 Teplotní závislost 77.5 77.8 78.1 78.4 Temperature increase 78.7 79.0
Time 80.2 79.9 79.6 79.3 79.0 78.7 78.4 78.1 77.8 77.5 Temperature increase

11 Průběh vyšetření Výběr SNP nebo bodové mutace Vyhledání v databázi Tm
Optimalizace CE-gradientu Potvrzení mutací sekvenováním Navržení primerů Optimalizace PCR VZOREK Izolace DNA PCR amplifikace a tvorba heteroduplexů TGCE Vyhodnocení

12 (CE separace za podmínek částečné denaturace)
Metodika (CE separace za podmínek částečné denaturace) Vzorek DNA izolace PCR amplifikace CE analýza Vyhodnocení

13 „Mutační spektrometrie“
Vysoké rozlišení Specifické profily, charakteristické polohy píků

14

15 Vysoká citlivost Citlivost mutační detekce (<10% mutované DNA)
mutant > 20% mutant < 10 % (mutační spektrometrie)

16 Aplikace

17 Prediktivní genetická diagnostika
Testování výskytu mutací FVL Faktor V Leiden Faktor II prothrombin MTHFR CFTR Hemochromatóza Hypercholesterolémie Fenylketonurie

18 Onkologická diagnostika
Testování somatických mutací KRAS2 TP53 APC EGFR CDKN (p16INK4A) BRCA1 BRCA2 APC 60 40 minutes TA + C T 60 40 minutes 1450 CT

19 Genotypizace SNP pro predikci léčebné odpovědi/toxicity
Farmakogenomika Genotypizace SNP pro predikci léčebné odpovědi/toxicity ERCC1 (C118T) ERCC2 (G312A) MDR1 (C3435T) CCND1 (A870G) CYP17A1 CYP3A4

20 Diagnostika predispozice nádorů
Genotypizace SNP v predispozici výskytu nádorů CCND1 (A870G) SRD5A2

21 Diagnostické kity ABI PRISM® 310 ABI PRISM® 3100 Avant ABI PRISM® 3100
Beckman CEQ™ 8000 MegaBACE™ 500 MegaBACE™ 1000 Agilent Bioanalyzer 2100

22 Shrnutí Jednoduchý jednostupňový postup
Citlivost při detekci somatických mutací Specificita (mutační spektrometrie) Bez nutnosti pořizování nákladné instrumentace Vysoká kapacita (multikapilární přístroje) Nízké náklady

23 Poděkování Laboratoř molekulární genetiky a onkologie, Genomac International, s.r.o. Patrik Sekerka Ing. Michala Hrabíková Ing. Radka Slováčková Kateřina Kramperová Barbora Belšánová Andrea Krajčová MUDr. Cyril Šálek Lucie Kašperová Podporováno projektem Ministerstva Průmyslu a Obchodu č. FI-IM3/215

24 Děkuji Vám za pozornost
Bavorská 856 Praha 5