Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací

Prezentace na téma: "Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací"— Transkript prezentace:

1 Možnosti průtokové cytometrie v analýze mikrobiálních populací
Barbora Branská Vysoká škola chemicko technologická v Praze Ústav kvasné chemie a bioinženýrství

2 Mikroorganismy a průtoková cytometrie
Konstrukce cytometrů Velikost – (detekce částic, intenzita odezvy, rel. fluorescenční odezva) Tvar buněk Minimum informací x rozmanitost mikroorganismů

3 Mikroorganismy Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris
produkční systém pro syntézu rekombinatních proteinů, indukovatelný silný promotor AOX Thermus sp., T. ruber, T. aquaticus biodegradační schopnosti, syntéza termostabilních enzymů

4 Hlavní body z biotechnologického pohledu
Morfologické znaky Viabilita Enzymová aktivita Obsah intracelulárních složek Růstová dynamika Fyziologické změny

5 Morfologie Cytometrie Mikroskopie + analýza obrazu Velikost - FSC, EV
Tvar - SSC Mikroskopie + analýza obrazu Velikost - plošný obsah Tvar – šířka, délka, cirkularita,…

6 Morfologie cytometr x mikroskop

7 Fluorescenční značení - viabilita
Membránová integrita Propidium jodid, ethidium bromid, Sytox green Transmembránový potenciál Rhodamin123, DiOC2(3), bis-oxonol Enzymová aktivita Fluorescein diacetát, karboxyfluorescein diacetát

8 Integrita buněčných membrán
Propidium jodid náboj +2 neproniká do prokaryotních ani eukaryotních buněk s intaktní membránou červená fluorescence, 20 x vyšší po vazbě na NK Ethidium bromid náboj +1 pomalu proniká buněčnými membránami Sytox green z živých buněk plně vylučován zelená fluorescence, 1000 x vyšší po vazbě na NK

9 Membránová integrita PI EB Sytox
Směs vitálních a fixovaných b. S. cerevisiae PI EB Sytox

10 Transmembránový potenciál
Rhodamin 123 Kladný náboj Akumulace v buňce v závislosti na transmembránovém potenciálu Zelená i červená fluorescence DiOC2(3) Akumulace v buňce v závislosti na transmembránovém potenciálu – změna intenzity červené fluorescence Bis-oxonol Záporný náboj Akumulace v depolarizovaných buňkách Vazba na nepolární kompartmenty

11 DiOC2(3), Rhodamin 123 Pichia - mix Saccharomyces - mix Thermus
vitální fixované

12 BOX

13 Esterázová aktivita Fluorescein diacetát Karboxyfluorescein diacetát
lipofilní, nenabitá a nefluorescentní sonda, snadno prochází buněčnými membránami, v buňkách je hydrolyzována nespecifickými esterázami na anion fluoresceinu špatná retence v buňkách Karboxyfluorescein diacetát podobné vlastnosti jako FDA větší molekula, hůř prochází neporušenými membránami lepší zádrž produktu v buňce

14 FDA - viabilita Saccharomyces Histogram pichia fda

15 CFDA Saccharomyces, Pichia Thermus vitální vzorek - nízká fluorescence
fixované buňky - vysoká fluorescence Thermus vitální vzorek - jasná fluorescence fixované buňky - téměř bez fluorescence

16 FDA – esterázová aktivita

17 DNA – buněčný cyklus, FITC
interakce s neprotonovanými alifatickými amino-skupinami → s N-koncem polypeptidu a ε-aminoskupinou lysinu Srovnání s biuretovým spektrofotometrickým stanovením

18 Statistické vyhodnocení - opakovatelnost
PI FDA CFDA DiOC2(3) Rh 123 BOX Saccharomyces SD 0,4 0,48 1,89 3,06 1,36 RSD 0,79 0,92 2,5 5,04 3,08 Pichia 0,75 1,22 2,87 1,11 2,59 1,91 4,5 3,28 Thermus 1,52 2,72 0,52 2,74 2,65 2,1 3,63 1,12 3,96 3,42 3,69

19 Děkuji za pozornost