Cílená léčba nádorových onemocnění – fikce, nebo naděje?

Prezentace na téma: "Cílená léčba nádorových onemocnění – fikce, nebo naděje?"— Transkript prezentace:

1 Cílená léčba nádorových onemocnění – fikce, nebo naděje?
Karel Ulbrich Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i.

2 Obsah přednášky Úvod do problematiky polymerů ve farmacii a polymerních léčiv Polymerní léčiva - konjugáty polymerů a nízkomolekulárních léčiv, polymerní kancerostatika Využití poznatků při dalších aplikacích - vektory pro genové terapie, diagnostika Závěr a výhledy

3 Co může zlepšit použití syntetických polymerů při přípravě léčiv a lékových forem?
Klasické nízkomolekulární léčivo Polymerní formy léčiv Konc čas [ hod] 4 8 dny - rok protrahovaný účinek řízené uvolňování řízené uvolňování cílený transport Opakované dávkování v relativně krátkých časových intervalech, vedlejší a často toxické účinky, v řadě případů malá účinnost léčby Potřeba jedné nebo jen několika dávek, malá spotřeba léčiva, minimalizace vedlejších účinků, účinnější léčba

4 Helmut Ringsdorf, 1976 model polymerního léčiva
Paul Ehrlich, 1908 „Magic Bullet“ – první představa o cílně působícím léčivu Helmut Ringsdorf, 1976 model polymerního léčiva Jindřich Kopeček: 1978 – model polymerních konjugátů s řízeným uvolněním léčiva Helmut Ringsdorf Jindrich Kopecek

5 Požadavky na „ideální“ léčivo
Léková forma, ve které je léčivo neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami) v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka) aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu

6 Návrh struktur vyhovujících postulovaným požadavkům
Syntéza „knihoven“ látek o různé struktuře a pomocí screeningových metod provést výběr Pochopení vztahu mezi strukturou a vlastnostmi polymerních systémů použít pro návrhy struktur „na míru“ připravovaných polymerních léčiv

7 Schéma klasického polymerního léčiva
Biodegradovatelná spojka (oligopeptid, hydrolyticky štěpitelná spojka) Léčivo (model) Směrující struktura: sacharid, lektin, protilátka (IgG a fragmenty), hormon, specifický oligopeptid

8 Multivalentní HPMA kopolymery používané pro syntézu polymerních konjugátů (příklad nejpoužívanějších struktur) Příprava klasickou a nebo řízenou (RAFT) radikálovou polymerizací C H 3 C H 3 C H 2 C C H 2 C C O C O x b N H C H 2 C H O H C H 3 C O N H 2 H2 5 N S R-C=O NH2 SH

9 Reaktivní prekurzor Protilátkou směrované polymerní léčivo - hřeben
Protilátkou směrované polymerní léčivo - hvězdice Polymerní léčivo Reaktivní prekurzor Polymerní léčivo s kombinovaným účinkem Polymerní léčivo – roubovaná struktura Polymerní micelární léčivo Polymerem modifikovaný virus pro genovou terapii Polymerní léčivo s kombinovaným účinkem – dvě léčiva

10 Polymer – řetězec molekul (monomerů ) složený do makromolekuly
Fyzikální a chemická struktura syntetických polymerů Lineární a větvená struktura Polymer – řetězec molekul (monomerů ) složený do makromolekuly Roubovaná struktura polymerní síť hvězdicová struktura Kopolymery a terpolymery

11 Vodorozpustné polymerní konjugáty s léčivy

12 Možnosti uvolňování léčiva z polymerního nosiče
(b) (c) (a) Uvolnění v krevním řečišti Uvolnění ve tkáni po extravazaci Specifické uvolnění v cílových buňkách po endocytose Cévy Cévy

13 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv
Stabilita v průběhu transportu - chemická vazba léčiva na nosič Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

14 (enzymatická aktivace léčiva)
Schéma klasického konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicin (PK1) (enzymatická aktivace léčiva) O H C 3 2 NH a x N Enzymaticky degradovatelný oligopeptid: -GlyPheLeuGly- Místo enzymatického štěpení

15 Schéma hydrazonového konjugátu poly(HPMA) s kancerostatikem doxorubicin (pH závislá hydrolytická aktivace léčiva) N H O C 3 2 . l a x Jednoduchá vazba nebo spacer Místo hydrolytického štěpení

16 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv
Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

17 Princip enzymaticky řízeného uvolňování léčiva z polymerního nosiče uvnitř cílové buňky
Spojka (oligopeptid) Gly-Phe-Leu-Gly--- DOX Model léčiva, léčivo (DOX) Substrát (oligopeptid) S4 S3 S2 S1 S1´ S2´ S3´ Aktivní místo enzymu (proteázy) ENZYM

18 % UVOLNĚNÉHO DOXORUBICINU V SÉRU
Uvolňování DOX z polymerů při inkubaci PHPMA-X-DOX konjugátů se směsí lysosomálních enzymů - tritosomů STRUKTURA % UVOLNĚNÉHO DOXORUBICINU V SÉRU 3 h 6 h 24 h -GFLG- 0.7 0.8 1.9 -GLFG- 0.5 1.5 -GG- 0.1 0.2

19 Uvolňování DOX z hydrazonových polymerů inkubovaných ve fosfátových pufrech o různém pH modelující prostředí v krvi (7.4) a uvnitř buněk (5.5) pH 5.5 pH 7.4

20 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv
Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

21 Princip pasivního směrování – akumulace
polymerů v pevných nádorech (EPR efekt) (H. Maeda a kol.) Nádorová tkáň Normální tkáň Málo propustný endothel Porézní kapilární systém Fungující lymfatický systém Těsné kapiláry nebo chybějící lymfatický systém

22 Biodistribuce poly(HPMA) nosiče v myši s B16F10 melanomem
Biodistribuce poly(HPMA) nosiče v myši s B16F10 melanomem. Vliv Mw na distribuci. Biodistribuce poly(HPMA) nosiče (Mw 60 kDa) v kryse s prostatickým AT1 nádorem, závislost na čase.

23 Konjugáty umožňující pasivní směrování do pevných nádorů
Nedegradovatelné polymerní léčivo (limit Mw ~ g/mol) Micelární polymerní léčivo Biodegradovatelné vysokomolekulární polymerní léčivo dendritické struktury Biodegradovatelné vysokomolekulární roubované polymerní léčivo

24 Struktura micelárního PHPMA-DOX konjugátu (s cholesterolem a pH-řízeným uvolňováním DOX)
Vodné prostředí Mw(pol) = 32 kDa I = 1.8 Mw(mic) = 170 kDa [DOX] = 7 wt% [cholesteryl] = 3.5 %mol dmic = 22 nm

25 Syntéza roubovaných konjugátů s řízeným uvolňováním Dox a řízenou biodegradací
+ +

26 Hypervětvená polymerní léčiva na bázi dendrimeru
DOX + Semitelechelický HPMA kopolymer Jednoduché dendritické jádro PAMAM dendrimery G1 Mw~ In~1.8 to 2.3 Rh~ nm Mw~ In~2.0 to 2.6 Rh~ nm G2

27 Uvolnění Dox z micelárního a roubovaného nosiče na bázi HPMA kopolymeru, fosfátový pufr o pH 5 (nebo pH 5,5) a 7.4 , 37 °C pH 5 pH 7.4 pH 5.5 pH 7.4

28 Eliminace polymerních léčiv z krevního řečiště a akumulace do nádoru u B/6 myší nesoucích myší lymfom EL4. Porovnání s volným léčivem. Akumulace v nádoru Eliminace z oběhu Akumulace modelu léčiva DY-676 na lineárním (Mw 30 KDa) a HMW hvězdicovém polymerním nosiči sledované u nu-nu myši (HT-29 colon carcinoma) 49 h po injekci (konfokální laserová fluorescenční mikroskopie)

29 Aktivní směrování – internalizace polymerních léčiv v buňkách Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech lysosom primární endosom pH 5 - 6 Jádro sekundární lysosom, pH 5, enzymy

30 Schéma klasického protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace)
3 2 NH 150 kDa Oligopeptid -GlyPheLeuGly-

31 Schéma hvězdicového protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace)
S-CH2CH2-CO------TT DOX X

32 Směrování polymerních léčiv pomocí částí protilátky (scFv fragment), vazba pomocí komplexu proteinů BTX-BTXbp Směrování polymerních léčiv pomocí částí protilátky (scFv fragment), vazba pomocí komplexu proteinů BTX-BTXbp scFv-BTX: připravený metodami genového inženýrství (University of Oxford) BTX scFv BTX scFv BTX scFv Dox-PHPMA-BTXbp Dox-PHPMA-BTXbp scFv 30 kDa H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH scFv: anti-PSMA, M 75 Ab (karb. anhydráza),

33 Směrování polymerních léčiv pomocí částí protilátky (scFv fragment), vazba pomocí komplexu proteinů BTX-BTXbp Směrování polymerních léčiv pomocí částí protilátky (scFv fragment), vazba pomocí komplexu proteinů BTX-BTXbp scFv-BTX: připravený metodami genového inženýrství (University of Oxford) BTX scFv BTX scFv BTX scFv Dox-PHPMA-BTXbp Dox-PHPMA-BTXbp H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH

34 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv
Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Odstranění nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

35 Schéma degradace roubovaného konjugátu
(degradace v reduktivním prostředí buňky) Degradace v cílové buňce Vysokomolekulární léčivo s akumulací v pevném nádoru Nížemolekulární fragmenty vyloučitelné z organizmu

36 c(kathepsin B) = 5.10-7 mol/l c(glutathion) = 3.10-6 mol/l
Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou GFLG po inkubaci s kathepsinem B c(kathepsin B) = mol/l Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou -S-S- po inkubaci s glutathionem c(glutathion) = mol/l Vylučovací mez polymeru ledvinami

37 Degradace polymerního dendritického léčiva v pufru modelujícím prostředí uvnitř buňky
Velikost klubka ve fosfátovém pufru s NaCl (DLS) Reduktivní degradace c(glutathionu) = mol/l aqueous GPC, detection LS (Wyatt tech.) and RI column: Superose 6TM, mobil phase: acetate buffer pH 6.5 DLS measurement PBS pH 5.5

38 Protinádorová aktivita polymerních léčiv studovaná na modelových nádorech u myší
(růst nádoru, doba přežití, váha) Výsledky testů prováděných na MBÚ AV ČR. (a) In vitro testy (b) In vivo testy : terapeutický režim aplikace léčiva in vivo ( první aplikace po vytvoření nádoru, nejčastěji po 8 – 11 dnech od inokulace)

39 Směrované PHPMA-DOX konjugáty, výsledky in vivo testů (Balb/c myši, BCL1 leukemie i.p., léčba i.v.), terapeutický režim podání a) jedna dávka 5mg/kg, (hv 11 den) b) dvě dávky 11 a 14 den, 2x5mg/kg (kl)

40 (terapeutický režim podání)
Léčba C3H/HeN myší s 38C13 lymfomem (1x105, s.c.) doxorubicinem (5x2.5 mg/kg) nebo polymer-DOX konjugáty (ekvivalent 5 mg/kg DOX) aplikovanými 8 a 11 den (terapeutický režim podání)

41 Ptotilátkami směrované polymerní konjugáty kancerostatik
Výhody: vysoká účinnost léčby, jsou účinné i při nízkých koncentracích Nevýhody: jsou velmi specifické, není snadná příprava ve větším množství a je drahá, nepůsobí obecně na více typů onemocnění

42 Lineární konjugáty PHPMA-DOX s hydrazonovou vazbou: výsledky in vivo testů, nesměrovaný lineární konjugát - terapeutický režim podání Myší T-buněčný lymfom EL4, myši C57BL/6, léčba i.p. 10 nebo 10 a 20 den Hydrolyticky štěpitelná vazba, pH závislá rychlost štěpení

43 Vysokomolekulární roubované polymerní konjugáty DOX (Hydrazon) – In vivo protinádorová aktivita
105 buněk T-buněčného lymfomu EL4 inokulovaných myším B/6 v den 0. Léčba: den 11. i.v. , jednoduchá dávka 15 mg DOX ekv./kg A – konjugát s enzymatickou degradací B – konjugát s reduktivní degradací

44 Vysokomolekulární micelární konjugáty PHPMA-DOX
Doba přežití B/6 myší s inokulovaným EL-4 T-buněčným lymfomem (s.c.) léčených 8 (a příp. 12) den po inokulaci jednou nebo dvěma dávkami léčiva

45 Léčba dendritickým a roubovaným léčivem, EL4 T-buněčný lymfom, léčba 9 den po inokulaci
Dávka 15 mg DOX eq./kg Dávka 10 mg DOX eq./kg Polymerní konjugát (Mw ≈ , In = 1.9, DOX = 10.2 wt.%)

46 Konjugáty PHPMA-DOX směrované scFv fragmentem anti-PSMA protilátky
Konjugáty PHPMA-DOX směrované scFv fragmentem anti-PSMA protilátky. Vazba DOX přes GFLG oligopeptid, scFv fragment anti-PSMA protilátky. Nádor prostaty PC346C v athymických myších. Dávka 2 x 0.05 mg DOXekv/kg. BTX scFv R. Willemsen, Erasmus Centre, Rotterdam

47 Maximální tolerovaná dávka léčiva PHPMA-DOX v myších

48 Přežití B/6 myší vyléčených od EL-4 lymfomu a retransplantovaných novou smrtelnou dávkou nádorových buněk EL 4 lymfomu (105) Micelární konjugáty lišící se strukturou hydrofobního jádra Hvězdicové konjugáty lišící se strukturou degradovatelné spojky (enzymaticky či reduktivně štěpitelné)

49 Využití poznatků z vývoje rozpustných polymerních konjugátů v diagnostice a genové terapii

50 Konjugát gadolinia pro diagnostiku (angiografii) magnetickou resonancí
Hmotová spektroskopie: (5.19±0.28) %váh. Gd Kontrastní látka: 0.5 M (78 mg/ml Gd) Komplex je stabilní (neuvolňuje Gd) minimálně po dobu 2 měsíců inkubace C H 3 C H 3 C H C C H C 2 2 C O C O N H N H C H C H 2 2 H C O H C H 2 C H 3 C H 2 C H 2 C H 2 C O N H MW: 24.8 kDa Mw/Mn: 1.92 H C C H C O N H C H C O O H 2 C O C H 2 N H C O O H H C C H C O O H 2 Gd C O O H

51 MR-Angiografie u krysy, porovnání komplexu poly(HPMA)-Gd s Gd-DTPA,
1.5 T MR scanner: 0.02 mmol/kg poly(HPMA)-Gd Magnevist firmy Schering * Krebsforschunginstitut Heidelberg

52 MRI zobrazení krysy, pohled z břišní strany, různá hloubka zobrazení
Univerzita Olomouc

53 Syntetické polymery jako součást vektorů pro genovou terapii

54 Genová terapie Gen Vektor genové informace
moderní léčebná technika založená na dopravě DNA nebo specifického genu do cílové buňky pacienta za účelem opravy či náhrady poškozeného genu, inhibice replikace genu a nebo vyvolání geneticky podmíněného zániku celé buňky Gen specifická část molekuly DNA (určená přesným pořadím nukleotidů) schopná replikace, která nese samostatnou jednotku genetické informace Vektor genové informace přenašeč genetické informace schopný dopravit gen do cílové buňky, nebo až do buněčného jádra (vektory jsou nevirální syntetické a nebo virální, adenoviry a retroviry).

55 Požadavky na vektory pro dopravu genu účinné v in vivo podmínkách
Stabilita v krevním řečišti, minimální interakce s buňkami imunitního systému Extravazace do cílové tkáně Interakce s receptory cílových buněk Endocytoza Únik z endosomu do cytoplasmy Transport k buněčnému jádru Účinná transfekce, transdukce a produkce aktivního proteinu

56 Rekombinantní adenovir: potenciální vektor pro nádorovou genovou terapii
Požadavky na intravenozní aplikaci: Virus se nesmí vázat na erythrocyty a neutrofily Nesmí napadat makrofágy a buňky RES Nesmí docházet k neutralizaci protilátkami a komplementem Nesmí docházet k záchytu viru v jaterních buňkách Musí být schopen specifického směrování k vybraným buňkám (retargeting) Receptory: coxsackie a adenovirus receptory (CAR), receptory pro „fibre knob“ ligandy

57 Povrchová modifikace viru hydrofilním polymerem
Reaktivní esterová skupina Aminoskupina + Semitelechelický monovalentní polymer PEK, Virus Modifikovaný virus + Rekombinantní adenovirus nesoucí specifický gen Klasický multivalentní polymer se směrující skupinou

58 Osud povrchově modifikovaného viru v cílové buňce
Prostředí v buňce Extracelární prostředí Ochranný polymer adenovirová kapsida Přesměrovaný virus endosom pH < 6 GSH Směrující struktura Uvolnění DNA Degradovatelné vazby Buněčná membrána

59 Příklad HPMA kopolymerů určených pro povrchovou úpravu virálních nosičů genu
3 C H 3 C H 3 C H 3 C H 2 C C H 2 C C H 2 C C H 2 C C O C O C O C O N H O N H N H C H 2 ( C H 2 ) 2 ( C H 2 ) 2 ( C H 2 ) 2 C H O H C H 3 N C H 3 N H N H C H C l 3 C H 3 C O C O ( C H 2 ) 2 ( C H ) 2 2 Reduktivně štěpitelná vazba (v cytoplasmě) S S S S ( C H ) 2 2 ( C H 2 ) 2 C O C O N EGF S S

60 Modifikace virů kopolymerem HPMA obsahujícím směrující skupinu
Nemodifikovaný virus Polymerem modifikovaný virus

61 Asociace s buňkami (FACS) Transgenní exprese genu
Polymerem modifikovaný nesměrovaný adenovirus Ad5-GFP ztrácí schopnost účinně infikovat buňky (A549 – plicní nádor), připojením směrující struktury se aktivita specificky obnoví Polymerem modifikovaný virus Virus retargetovaný pomocí bFGF Nemodifikovaný virus Asociace s buňkami (FACS) Transgenní exprese genu Ad5-GFP

62 Exprese polymerem modifikovaného viru Ad5-GFP směrovaného humanizovanou protilátkou herceptinem
SKOV3 Ovariální nádor PHPMA modi-fikovaný virus Herceptinem retargetovaný virus Buňky Virus

63 Směrování adenovirů jako vektorů genové informace pomocí scFv specifických protilátek
BTX scFv BTX scFv BTX scFv scFv Ad-PHPMA-BTXbp H-GSGGSGGTGYRSWRYYESSLEPYPD-OH

64 ZÁVĚRY. Vodorozpustné polymerní nosiče léčiv na bázi kopolymerů HPMA představují významnou alternativu při vývoji pasivně i aktivně směrovaných kancerostatik. Polymerní cytostatika mají minimální vedlejší účinky, nepoškozují imunitní systém jako klasická cytostatika a vykazují, na rozdíl od klasické chemoterapie, kromě výrazně zlepšeného chemoterapeutického efektu i efekt imunostimulační. Tento efekt se uplatňuje u různých typů nádorů (u myší i u lidských pacientů). Polymerní nosičové systémy mají širokou škálu použití i v jiných oblastech medicíny, např. v diagnostice (MR zobrazení) a při vývoji systémů pro genovou terapii.

65 Poděkování spolupracovníkům
Týmu pracovníků oddělení biolékařských polymerů ÚMCH AV ČR Týmu Prof. Blanky Říhové, MBÚ AV ČR Týmu Prof. Lena Seymoura, University of Oxford, UK Kolegům na University of Halle (Prof. K. Mader) Akademii věd ČR za finanční podporu výzkumu (Akademická prémie)