Syntéza na pevné fázi – kombinatoriální chemie Miroslav Havránek RE&D VÚFB, s.r.o.

Prezentace na téma: "Syntéza na pevné fázi – kombinatoriální chemie Miroslav Havránek RE&D VÚFB, s.r.o."— Transkript prezentace:

1 Syntéza na pevné fázi – kombinatoriální chemie Miroslav Havránek RE&D VÚFB, s.r.o.

2 Princip syntézy na pevné fázi

3 Kombinatoriální chemie 20 aminokyselin x 30 prim. aminů x 30 sec. aminů = 18 000 látek

4 Kombinanoriální syntéza Paralelní syntéza „Split and pool“ „Tea bags“ metoda

5 Paralelní syntéza Geysenova pinová aparatura na syntézu peptidů Aparatura S.H.DeWitt

6 „Split-and-pool“ syntéza 9 reakcí, 27 látek

7 Screening: dekonvoluce Testují se směsi Tato směs je aktivní Nová syntéza Tato směs je aktivní Aktivní látka je BA

8 „One-bead-one-compound“ Firma Selectide (Arizona) Na jedné kuličce je jen jedna látka Knihovna hexapeptidů... 20 6 = 64 000 000 členů 1 g polymeru ~ 1 000 000 kuliček 3 kopie knihovny (pro knihovnu 10 000 látek použít 30 000 kuliček) 95% pravděpodobnost že směs obsahuje určitou látku Screening na pevné fázi: Kulička s aktivní sekvencí se testem zbarví, sekvence se stanoví např. Edmanovým odbouráváním

9 Testování v roztoku Multicleavable linker – postupné uvolňování z resinu

10 Tea bags Richard A. Hougten Trega Biosciences : První 2-3 randomizace v T- bag, poslední v 96-well plate (paralelně)

11 Počátky kombinatoriální syntézy malých organických molekul

12 Ellmanova syntéza benzodiazepinů Bunin, B. A.; Ellman, J.A. J.Am. Chem. Soc. 1992, 114, 10997

13 Aminobenzofenony Aminokyseliny Alkylhalogenidy Celkem 192 látek 28 látek – kontrola HPLC/MS 20 látek – stanoven výtěžek (~86%) Kontrola ee čistoty Screening: CCK A receptor radioligandová assay Stavební bloky

14 Syntéza hydantoinů a benzodiazepinů S.H.DeWitt DeWitt, S. H.; Kiely, J. S.; Stankovic, C. J.; Schroeder, M. C.; Cody, D. M. R.; Pavia, M. R. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1993, 90, 6909 Hydantoiny: 8 AA, 5 izokyanátů Benzodiazepiny: 8 AA, 5 aminobenzofenon iminů Monitorování 13 C NMR

15 Zuckermanova syntéza peptoidů -stavební bloky: aminy (velká diverzita, komerčně dostupné) -horší výtěžky a čistota -velký nadbytek činidla -dlouhá reakční doba -stavební bloky: N-substituované Gly (nutno syntetizovat) -dobré výtěžky, čistota, možnost monitorovat průběh reakce (chloranil test) -krátká reakční doba Zuckerman, R. N.; Kerr, J. M.; Kent, S. B. H.; Moos, W. H. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 10646.

16 Plánování kombinatoriální syntézy

17 Resin PS Polystyren zesíťovaný divinylbenzenem Bobtná v DMF, NMP, DMSO,THF, DCM málo v MeOH, EtOH Loading 0.5-1.3 mmol/g PEG-PS Tentagel, Argogel, Novasyn TG Bobtná i ve vodě Loading 0.2-0.3 mmol/g Je dražší 1 kulička: 130  m, loading 0.3 nmol 800 000 kuliček v 1 g 1 mmol/g... 12% fenylů funkcionalizováno

18 Linker HAL Linker (0.1% TFA v DCM) Sasrin linker (1% TFA v DCM) Wang resin (TFA-DCM 1:1) Stabilní v TFA, štěpí se HF HMBA linker, štěpí se nukleofilně (působením aminu vznikne amid)

19 Rink amide linker – štěpení TFA Fotolabilní linker Safety-catch linker

20 Reakce – syntetická sekvence Byla reakce již prováděna na pevné fázi? Promyšlení sekvence – orthogonalita chránících skupin a linkeru Odzkoušení sekvence na modelové látce – jednoduché stavební bloky, vývoj reakčních podmínek - HPLC/ MS Odzkoušení jednotlivých stavebních bloků, úprava reakčních podmínek Syntéza modelové knihovny, HPLC/ MS Syntéza konečné knihovny, HPLC/ MS části knihovny

21 Monitorování průběhu reakce Barevný test:- ninhydrinový kaiser test - chloranilový test - na OH, CHO (moc nefungují) IČ spektra: přímo na resinu, vymizení-vznik píku NMR – Tentagel, magic angle spinning, 13 C, 19 F HPLC/MS – odebrat část vzorku, odštěpit, změřit

22 Syntéza diketopiperazinů

23 Syntéza pyridinů Hantzschova syntéza pyridinu Gordeev, M. F.; Patel, D. V.; Gordon, E. M. J. Org. Chem. 1996, 61, 924

24 Tadesse, S.; Bhandari, A.; Gallop, M. A. J. Comb. Chem. 1999, 1, 185

25 Syntéza močovin

26 Stavební bloky Diverzní knihovna Nediverzní knihovna variovatelné skupiny scafold

27 Kombinatoriální chemie ve farmaceutickém průmyslu Každá společnost zabývající se drug discovery Většinou paralelní syntézy, někdy paralelní chromatografie všech členů knihovny HTS: miniaturizace, robotizace, fluorescenční assaye (až 10 000 vzorků denně) Tradiční přístup Combichem Slouč. na 1 chemika měsíčně 43 300 Cena$30 000$40 000 Cena za látku $7 500$12 GlaxoSmithKline v roce 2000: 50% „drug leads“ objeveno komb. chemií

28 Nové protiplísňové látky: substituované imidazoly Saha, A. K.; Liu, L.; Simoneaux, R. L.; Kukla, M. J.; Marichal, P.; Odds, F. Bioorg. Med. Che,. Lett. 2000, 10, 2175

29 Saha, A. K.; Liu, L,; Marichal, P.; Odds, F. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2000, 10, 2735

30 Nature Product-Like Libraries Diversity Oriented Synthesis

31 Molekulární sondy Taxol: aktivuje samovolné uspřádávání tubulinů do mikrotubulí Rapamycin: Objev immunophilinu FKBP12, sensoru FRAP Tyto „nízkomolekulární“ látky ovlivňují proteiny. Tak můžeme sledovat úlohu proteinu v organismu.

32 Chemická genetika GEN ProteinEfekt Mutace Genetický přístup Molekula Chemicko-genetický přístup Mnoho proteinů lze ovlivnit malými molekulami. Zmíněné přírodní látky fungují jako molekulární sondy – vedou k objevu nových proteinů, nových mechanismů účinku. Screeningem mnoha látek tak můžeme najít nové molekulární sondy, prostředky k systematickému prozkoumávání biologických procesů. Organická syntéza tak může být základem nových objevů v biochemii.

33 Diversitně orientovaná syntéza „Target oriented synthesis“: konkrétní cíl (protein) „Diversity oriented synthesis“ : není určen cíl Velká diverzita, komplexní struktura (různé scafoldy) Sloučeniny připomínají svou strukturou přírodní látky (nature-product-like)

34 Knihovna 2 180 106 látek Tan, D. S.; Foley, M. A.; Stockwell, B. R.; Shair, M. D.; Schreiber, S. L. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 9073

35 Testovací knihovna (8 směsí po 64 látkách) Testováno na různé cíle: - Rapamycin-based growth inhibitor - Modulation of cyclin B degradation - Mink cell line proliferation  aktivuje TGF-  -responsive reporter gene Dekonvoluce, identifikace aktivních struktur Zopakováno na kódované split-pool knihovně 77 000 látek

36 Syntetizována 1 kopie knihovny – teoreticky 2946 látek Distribuováno do 384 well plates, uvolněno HF MS: Nalezeno 2527 látek (86%) – zásobní roztok pro screening Galathamine-like library Galathamine

37 Screening - phenotyp assay Specifický modulátor transportu proteinů z Golgiho aparátu, jeden z 2800 Galathamine-like library Screening na celých buňkách, monitorování transportu proteinu Schreiber: C&EN News, 2003, 3, 51 Ovlivňuje kardiovaskulární systém během vývoje Dánia pruhovaného, jeden z 1412. Knihovna biarylů Screening na embrya Dánia pruhovaného

38 Protein binding assay

39

40

41 Jiné kombinatorální syntézy Fluorous phase Syntéza na PEG rozpustném nosiči –Nízký loading Syntézy v roztoku –Multikomponentní reakce (Ugiho reakce) –Reagenty a scavenger resiny

42 Závěr Syntéza na pevné fázi - standardní metodika Paralelní syntéza, split-pool knihovny Komerční dostupnost stavebních bloků, reagentů, resinů, pipetorů, robotů... Kombinatoriální chemie v roztoku + na pevné fázi – high-throughput purifikace Výrazné zrychlení vývoje v drug-discovery, katalýze, (materiálové a supramolekulární chemii?), Objevy nových mechanismů v biochemii