Virusneutralizace v diagnostice chřipkové infekce Martina Havlíčková.

Prezentace na téma: "Virusneutralizace v diagnostice chřipkové infekce Martina Havlíčková."— Transkript prezentace:

1 Virusneutralizace v diagnostice chřipkové infekce Martina Havlíčková

2 Chřipka- nejpoužívanější testy KFR rutinně zavedená ve většině laboratoří, typově specifická, výborné zkušenosti u pandemie HIT pouze některá pracoviště, subtypově a variantně specifický VNT dostupný zpravidla jen v NRL citlivější než HIT, reaguje širší spektrum protilátek než u HIT ELISA, IF SRHT specifický test, pouze pro některé účely ve vakcinologii komerční sety, u IF nutná zkušenost s hodnocením stanoveny parametry pro práh pozitivity/protekci

3 Virusneutralizace Měří celé spektrum protilátek, které mají neutralizační schopnosti Proto je citlivější než HIT a KFR ALE: Nutnost práce s živým virem Virus musí mít dobré růstové vlastnosti v tkáňové kultuře – TCID 50 minimálně 10 -4 Test musí být optimálně vyvážen, vzhledem k jisté nestabilitě kultivačního systému není příliš robustní Nezbytný systém standardních pozitivních i negativních kontrol

4 Různé metodiky Očkování na buněčný monolayer Očkování přímo do suspenze buněk –tento dvojí přístup nemusí být stejně citlivý, především co do výše infekčního titru viru, který je pro reakci použit Redukce plaků Reakci významně ovlivňuje i kvalita a složení příslušného kultivačního média Vizualizace výsledků: –ELISA in situ –Hemaglutinace oba přístupy porovnatelné, HA jednodušší a rychlejší –Mikroskopické posouzení inhibice hemadsorpce –Posuzování CPE není u chřipky vhodné –Redukce plaků – pro širší využití nevhodné, striktně závislé na na schopnosti´použitého viru plakovat

5 Metodika používaná v NRL Adaptována dle Rowe a spol. 1999 –Inaktivovaná a vytitrovaná séra byla smíchána s virem v koncentraci 2x10 3 TCID 50 –2 hodiny inkubace při 37°C v 5% CO2 atmosféře –Přidána buněčná suspenze v koncentraci 350 000 buněk /ml –Inkubace 48 hodin –HA test pro hodnocení replikace viru/inhibice replikace

6 Vyvažování testu

7 Porovnání geometrických průměrů titrů protilátek proti viru pandemic H1N1 2009 v akutním a rekonvalescentním vzorku séra pomocí tří základních sérologických metod – KFR, HIT a VNT u 40 pacientů s PCR prokázanou infekcí Porovnání geometrických průměrů titrů protilátek proti viru pandemic H1N1 2009 v akutním a rekonvalescentním vzorku séra pomocí tří základních sérologických metod – KFR, HIT a VNT u 40 pacientů s PCR prokázanou infekcí

8 KFR

9 k provedení reakce je nejvhodnější virus s vysokým TCID50, aby test měl dostatečnou robustnost existuje více systémů testu, více médií a protokolů při vhodném nastavení jsou porovnatelné interpretace testu velmi záleží na nastavení kontrol, vyšetření každého vzorku ve dvojici je nutné korelace mezi HIT titrem a VNT titrem není pevná i relativně nízké titry v HIT (1:20) mohou mít ve VNT vysoký titr (1:80-1:160) nízké VNT titry (1:10-1:20) nejsou pravděpodobně vždy specifické a tvoří pouze pozadí reakce protektivní titr ve VNT – 1:80…. spíše 1:160 nutné stanovit, ani v metodice WHO není deklarován

10 Úskalí a nesnáze Dynamika jednotlivých testů nemusí být ve shodě, protože každým měříme odlišné spektrum protilátek V případě výrazné diskrepance mezi nálezy (např. výtěr PCR pozitivní, HIT nebo KFR negativní, ) lze situaci zpravidla verifikovat pomocí VNT IgM a IgA protilátky – doplňující význam, negativita nálezu v žádném případě nevylučuje proběhlou či probíhající infekci

11 Kdy je VNT vhodná aneb co od vyšetření očekáváme? –potvrzení již stanovené diagnózy (PCR pozitivita ve výtěru) –alespoň částečné vodítko pro terapii?? –diferenciálně diagnostický údaj?? –momentální stav protilátek proti danému viru (variantě) – sérologický přehled)  –Citlivé zhodnocení vývoje protilátek ve dvojici séra –Vyšetřování v pandemické situaci, průkaz protilátek proti novému viru