Masarykova nemocnice, o.z.

Prezentace na téma: "Masarykova nemocnice, o.z."— Transkript prezentace:

1 Masarykova nemocnice, o.z.
Genotypizace plodu Štolba P., Masopust J. Krajská zdravotní, a.s. Masarykova nemocnice, o.z. Transfuzní oddělení

2 Genotypizace krevních skupin plodu
využitelné při HON genotyp lze stanovit u systémů RH (D, c, E) Kell (K) Kidd (Jka) Duffy (Fya) největší význam genotypizace RHD

3 Zdroje fetální DNA – rizika odběru
Invazivní a riskantní výkony amniové fibroblasty – při amniocentéze 0,5-1% riziko spontánních potratů, 17% riziko FMH choriové klky 0,5-1% riziko spontánních potratů, nízké riziko FMH fetální krevní buňky – při kordocentéze vyšší riziko spontánního potratu než u amniocentézy vysoké riziko aloimunizace matky

4 Zdroje fetální DNA – rizika odběru
Neinvazivní výkony fetální buňky v mateřské periferní krvi neuplatnilo se pro nevýhodný poměr mateřských a fetálních buněk technologicky obtížné oddělení fetálních a mateřských buněk volná (nebuněčná) fetální DNA fetální DNA z plazmy matky množství fet. DNA stoupá v průběhu těhotenství abnormálně vysoké hladiny fet. DNA u patologických těhotenství

5 Volná fetální DNA volná fet. DNA rozptýlená v plazmě matky
koncentrace se postupně zvyšuje I. trimestr do 3 % III. trimestr až 6 % fet. DNA po porodu rychle mizí z cirkulace po císařském řezu za 4 – 30 min. po vaginálním porodu za 10 – 100 hodin

6 Odběr periferní krve matky
odebírá se min. 6 ml perif. krve matky termíny odběru je vhodné navázat na již existující schémata – gynekologická, genetická určení krevní skupiny matky – 12. týden riziko nedostatečného množství fetální DNA biochemický screening (MS AFP) – týden většinou dostačující množství fetální DNA termín pro určení genotypu je do týdne

7 Izolace volné fetální DNA
odběr periferní krve matky do 24 hod. odstranění buněčných elementů opakovanou centrifugací se odstraní veškeré buňky izolace volné nebuněčné DNA izolace doporučenou dg. soupravou / automatem izolace veškeré volné DNA DNA plodu tvoří cca 2 – 6 % z celkové volné DNA izolace dostatečného množství DNA pro min. 4 PCR okamžitá analýza vzorku / zamrazení vzorku

8 Protokoly genotypizace RHD genu
gen RHD obsahuje 10 exonů, část sekvencí shodná s RHCE genem více různých protokolů – detekce exonů exony 7 a 10 – Roullilac 2007, Hromadníková 2003 exony 4, 5 a 10 – Daniels 2004, Minon 2005, 2007 exony 5 a 10 – Christiansen 2007 exony 5 a 7 – Grootkerk 2006, Legler 2007 exony 4 a 7 – Singleton 2000 komerční kity Devyser RHD kit (čeká na udělení CE-IVD) - exon 4

9 Protokoly genotypizace RHD genu
doporučení testovat nejméně 2 exony (kontrola) kombinace exonů 7 a 10 je v současnosti otestovaná k použití v ČR (doc. Hromadníková) kombinace jiných exonů je v ČR též použitelná u kombinace exonů 5 a 7 lze u černošské populace detekovat pseudogen RHDΨ (hlavní D-negativní alela Afričanů) v ČR je zatím tato minorita zanedbatelná

10 Metodika genotypizace RHD genu
amplifikace fetální DNA metoda real-time PCR specifické značené hydrolizační sondy kvantitativní metoda umožňuje odlišení mateřské a fetální DNA

11 Taqman sondy - FRET sonda obsahuje fluorochrom (F) a zhášeč (Q)
exonukleázová aktivita (5´3´) Taq polymeráza uvolňující fluorochrom volný fluorochrom emituje záření záření flourochromu je zachyceno přístrojem a zpracováno

12 real-time PCR PCR v reálném čase – měření intenzity fluorescence při narůstajícím množství PCR produktu záření PCR zkumavka blok PCR cycleru vzorek čočka

13 RHCE a Kell genotypizace plodu
RHCE genotypizace detekce oblasti exonu 2 (alela c) detekce oblasti exonu 5 (alela E) nelze vyšetřit pokud těhotná má některou z variant Kell genotypizace detekce SNP z exonu 6 zatím nelze použít dříve než ve 20. týdnu (v případě malého množství fetální DNA hrozí riziko falešných negativit)

14 Interní kontroly interní kontroly amplifikace
amplifikační kontroly (β-globin) kontrola fetální DNA – plod mužského pohlaví (SRY) testování 8 polymorfismů inzercí a delecí ve vybraných lokusech – chybí v mateřské DNA univerzální markery fetální DNA fetální hypermetylované sekvence – gen RASSF1A fetální hypometylované sekvence – gen SERPIN B

15 Výhody x nevýhody vyšetření
+ vyšetření genotypu (RHD) plodu s použitím volné nebuněčné fet. DNA je NEINVAZIVNÍ + vysoká specificita (>99,1 %) a senzitivita (>99,5 %) vyšetření - riziko falešné negativity (i při použití fetálního markeru) - u Dw těhotných nelze určit RHD genotyp plodu - nemusí vždy souhlasit s fenotypem (mutace, přestavby genů)

16 Děkuji za pozornost a hezký zbytek dne