Proč vibrační spektroskopie ?

Prezentace na téma: "Proč vibrační spektroskopie ?"— Transkript prezentace:

1 Proč vibrační spektroskopie ?
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 1 strukturní informaci lze získat v relativně krátkém čase (proto nachází využití například v proteomice) neomezuje se pouze na statický obrázek (citlivost ke změnám, možnost dynamických studií) velikost studovaných molekul a povaha okolního prostředí nepředstavují žádné omezení (a nebo jen výjimečně) je to mimořádně vhodná metoda pro zkoumání vztahu mezi strukturou a funkcí biomolekul

2 Výhody vibrační spektroskopie
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 2 RS a IČ jsou nedestruktivní metody (možnost testování biologické aktivity po skončení měření). Aplikovatelné na vzorky libovolné morfologie (roztoky vodné i nevodné, suspenze, precipitáty, gely, vrstvy, vlákna, prášky, monokrystaly, …). Pro biomolekuly lze tak ověřit nakolik se shoduje či naopak odlišuje jejich struktura v krystalu a v roztoku. Nenáročné na objem vzorku (cca 10 ml pro konvenční RS, 20 ml pro IČ). Rychlá časová škála absorpce i rozptylu ( s)  využití vibrační spektroskopie pro časově rozlišené studie procesů, které nejsou přístupné pomocí fluorescence či NMR. Existence rozsáhlé databáze IČ a Ramanových spekter (včetně přiřazení pásů jednotlivým vibracím a známých strukturně-spektrálních korelací).

3 Specifické výhody Ramanovy spektroskopie
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 3 Voda představuje pro Ramanovu spektroskopii ideální rozpouštědlo (na rozdíl od IČ). Intenzívní pásy v Ramanových spektrech pocházejí od vibrací, při kterých dochází k velké změně polarizovatelnosti (např. aromatické molekuly). Relativně snadné měření i v oblasti nízkých vlnočtů (pod 400 cm-1, daleká IČ oblast) Selektivní rezonanční zesílení (tzv. rezonanční Ramanův jev). Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)

4 Nevýhody vibrační spektroskopie
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 4 Spektrální rozlišení je sice vyšší než v elektronových spektrech, ale nižší ve srovnání s NMR. Nedostatečné rozlišení může být částečně kompenzováno chemickou (izotopická záměna) nebo biologickou (bodová mutace) modifikací. Jsou potřeba relativně vysoké koncentrace vzorku ( 10-100 g/l) byť v malých objemech. Jak H2O tak i D2O nejsou ideálním rozpouštědlem pro IČ spektroskopii (na rozdíl od Ramanova rozptylu). Ramanův jev (nepružný rozptyl světla) je ze své podstaty slabý jev (ve srovnání s absorpcí nebo emisí světla). Je tedy nutná značná čistota vzorků a péče při manipulaci s nimi (velmi vadí fluorescence příměsí).

5 Vibrační konformační markery
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 5 Pásy ve vibračním spektru představují detailní a jedinečný „otisk prstu“ dané molekuly. Složité molekuly  vibrační módy a jim příslušející spektrální pásy nemohou být přímo přiřazeny souřadnicím výchylek atomů ani z nich jednoduše vypočítány. vibrační spektrum nelze použít pro výpočet struktury. Vibrační spektrum daného strukturního motivu nemůže sloužit jako „otisk prstu“ této struktury dokud s ní není korelováno pomocí nezávislé metody. Jako základ pro stanovení takové korelace zpravidla slouží struktury určené pomocí difrakčních nebo NMR metod. Každý pás ve spektru odpovídá vibraci specifické skupiny atomů (tzv. normální vibrační mód) s dobře definovanými geometrickými charakteristikami (délka vazby, vazebné úhly, atd.)  správně přiřazený pás může sloužit jako jednoznačný indikátor (strukturní marker) tohoto strukturního rysu.

6 C2’ endo/anti (pyrimidiny)
Kanonické struktury DNA Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 6 C2’ endo/anti C3’ endo/anti C2’ endo/anti (pyrimidiny) C3’ endo/syn (puriny) B-DNA A-DNA Z-DNA Obrázky skeletu B-DNA, A-DNA, a Z-DNA. Každé vlákno B-DNA a A-DNA obsahuje 20 nukleotidů stejné sekvence. Z-DNA je tvořena alternujícími GC páry.

7 Spektra kanonických struktur DNA
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 7 Ramanova spektra krystalů A-, B-, a Z-DNA. Označeny jsou nukleosidové a páteřní konformační markery.

8 Určení struktury RNA·DNA hybridu v roztoku
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 8 A·B hybrid B-form A-form A-form Ramanova spektra poly(rA).poly(dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (A·B hybridní struktura) poly(dA-dT).poly(dA-dT), pH 7.5 v 0.1 M NaCl (B-form) poly(dA-dT).poly(dA-dT) vlákno při 75% relativní vlhkosti (A-form) poly(rA).poly(dT) vlákno při 75% relativní vlhkosti (A-form)

9 Interakce poly(rA) s poly(rU) v roztoku
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 9 Soubor Ramanových spekter série vzorků poly(rA) a poly(rU) s postupně se měnícím poměrem A:U od čistého poly(rU) (červené) k čistému poly(rA) (fialové). Spektra byla normalizována a signál rozpouštědla byl odečten.

10 Interakce poly(rA) s poly(rU)
Výsledky faktorové analýzy aplikované na první derivaci souboru Ramanových spekter směsi poly(rA) s poly(rU) s měnícím se poměrem A:U. faktorová dimenze = 4 Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 10

11 Interakce poly(rA) s poly(rU)
11 Byly identifikovány 4 složky: jednovláknová poly(rU), jednovláknová poly(rA), poly(rA).poly(rU) duplex a poly(rU):poly(rA)*poly(rU) triplex. Byla izolována spektra čistých komponent.

12 Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS)
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 12 Mechanismy zesílení m = a . E povrchový plasmon

13 Příklady SERS aktivních povrchů I
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 13 zdrsněná elektroda ostrůvkovité filmy Sanchéz-Cortés et al. Langmuir 17, 1157 (2001)

14 kovové koloidy (připravené chemicky nebo laserovou ablací)
Příklady SERS aktivních povrchů II Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 14 kovové koloidy (připravené chemicky nebo laserovou ablací) vlnová délka (nm) vlnová délka (nm) vlnová délka (nm)

15 Laserová ablace laserová ablace - příprava chemicky čistého koloidu
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 15 laserová ablace - příprava chemicky čistého koloidu Munro et al., Langmuir 11, 3712 (1995) Nd/YAG pulzní laser, 1064 nm, opakovací frekvence 10 Hz , délka pulzu 20 ns, 7 ml Ag koloidu je připraveno během 15 minutové ablace Procházka et al., Anal. Chem. 69, 5103 (1997)

16 koloidní částice imobilizované na silanizovaných skleněných podložkách
Příklady SERS aktivních povrchů III Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 16 koloidní částice imobilizované na silanizovaných skleněných podložkách

17 PORPHYRIN METALATION IN Ag COLLOIDAL SYSTEMS
5, 10, 15, 20-tetrakis(1-methyl-4-pyridyl) porphyrin (H2TMPyP)  Ag+ FREE BASE PORPHYRIN METALATED PORPHYRIN

18

19 PORPHYRIN METALATION (Undesirable or desirable effect?)
Direct adsorption of free base porphyrin onto the metal surface  PORPHYRIN METALATION  Impossible to obtain SERS spectrum of unperturbed free base porphyrin Irreproducibility of spectral measurement   Can we protect porphyrin against metalation? Yes, by appropriate molecular spacer Can metalation serve to obtain information about Ag colloid/porphyrin system and porphyrin itself? Detail investigation and quantitative analysis of metalation process Determination of metalation kinetics as a probe of Ag colloid/porphyrin systems

20 QUANTITATIVE ANALYSIS OF METALATION PROCESS
Hanzlíková et al., J. Raman Spectr. 29, 575 (1998)  = 1 - exp (- t / ) 1. FACTOR ANALYSIS (singular value decomposition algorithm) 2. Construction of SERRS spectra of PURE PORPHYRIN FORMS as a linear combination of subspectra 3. Determination of METALATION KINETICS as a time-dependent fraction of pure metalated porphyrin forms in the original spectra

21 Návrh rychlého DNA sekvenátoru na principu SERS
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 21 Kneipp et al., Appl. Spectrosc. 60, 322A (2007)

22 Single molecule SERS „blinking“
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 22 „blinking“ Time-elapsed video image of intermittent light emission recorded from a single silver nanoparticle. The elapsed time between images is 100 ms, and the signal intensities are indicated by gray scales.

23 Biosenzory založené na SERS ?
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 23 Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) Surface Plasmon Resonance (SPR) Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) lmax of LSPR depends on the size, shape, interparticle spacing, dielectric properties of particles and local environment SERS can detect the presence of particular species and/or their interactions

24 Biosenzory založené na SERS ?
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 24 JACS 127, 2264 (2005)

25 Biosenzory založené na SERS ?
Ramanova spektroskopie jako nástroj pro studium (bio)molekul 25