Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií

Prezentace na téma: "Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií"— Transkript prezentace:

1 Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií
Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecká fakulta MU Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií Bi7050 Část III Zbyněk Zdráhal Centrální laboratoř-Proteomika, CEITEC-MU Oddělení funkční genomiky a proteomiky, ÚEB PřF

2 Analýza proteomu proteinů je podstatně víc než genů
lidský genom obsahuje ~ genů, ale lidský proteom může obsahovat ~ proteinů a jejich forem (izoformy, PTMs) ( ~ proteinů v buňce v každém okamžiku široký rozsah koncentrací proteinů (~ 10 řádů) nutnost účinné separace majoritních proteinů od minoritních, chybí obdoba PCR reakce používané pro amplifikaci DNA široké spektrum fyzikálně-chemických vlastností analýza komplexů pro úplné pochopení buněčných procesů mnohdy nestačí prostá identifikace jednotlivých proteinů, cca 80% je funkčních jako součást komplexů

3 GIGO Pečlivá příprava vzorku – základní kámen úspěchu Bi7050
zachování původního proteinového složení zachování modifikací (např. inhibitory fosfatáz) ...

4 Bi7050 Keratiny !!! from skin, hair, nails, wollen clothes …. EVERYWHERE In-gel digestion of very weak Ag stained band zbytky media detergenty netěkavé pufry EGs ....

5

6 Standardní 1-D postupy Bi7050 1-D GE 1-D LC-MS/MS JEDNODUCHÉ SMĚSI
Separace proteinů Specifické proteolytické štěpení MALDI-MS/MS LC-MS/MS 1-D LC-MS/MS shotgun proteomics Specifické proteolytické štěpení Separace naštěpených peptidů MS/MS

7 snížená možnost detekce minoritních komponent
Bi7050 cca 50 bandu Proteinový extrakt fága – 1-D separace kDa 66.2 45.0 31.0 21.5 14.4 97.4 GE Iden. – 5 majoritních proteinů LC/MSMS koncentrační rozsah snížená možnost detekce minoritních komponent rozhoduje instrumentace podmínky LC separace

8

9 2-D Klasické 2-D postupy Bi7050 2-D GE 2-D LC-MS/MS on-line/off-line
MALDI-MS MALDI-MS/MS 2-D GE Separace proteinů Specifické proteolytické štěpení LC-MS/MS 2-D LC-MS/MS Specifické proteolytické štěpení Separace naštěpených peptidů MS/MS on-line/off-line LC-MALDI

10 Proteinový extrakt fága – 2-D separace
Bi7050 2-D GE/MALDI-MS ≈ 700 skvrn ≈ 20 proteinů

11 On-line (“MudPIT”) Off-line 2-D LC Bi7050 Protein mix peptides MS/MS
digesce MS/MS 1D - SCX 2D - RP frakcionace step by step 1D - SCX Off-line UV Peptide fraction LC 2D - RP MS/MS Peptide fraction MudPIT (multidimensional protein identification technology)

12 Bi7050 2-D LC peptides On-line

13 On-line 2-D LC (peptides) Bi7050 1D-RP 2D-RP, frakce 5 mM
Dionex application note

14 Průměr HPLC kolony vs citlivost
Bi7050 Průměr HPLC kolony vs citlivost „Sensitivity increases with a decrease in column diameter because the same sample mass (amount) is eluted in a smaller volume. Therefore the concentration of the eluting peak is higher and the detection signal is stronger.“ Amer. Lab., 2001, 33 (10),

15 2-D LC On-line vs Off-line Bi7050 sorbenty
peptides sorbenty 1-D: ionex 2-D: reverzní fáze IMAC (fosfoproteiny) affinity (lectin – glyko) On-line vs Off-line automatizace flexibilita optimalizace kontinuální odběr frakcí

16 on-line off-line LC –MALDI Bi7050 (peptides) nano LC (RP) Peptide
fraction ESI-MS/MS on-line MALDI TOF/TOF MS off-line Depozice na MALDI target Archivace

17

18 LC separace komplexních proteinových směsí
Bi7050 LC separace komplexních proteinových směsí Protein mix Frakcionace I. Různé druhy detekce Protein 1D frakce Ionex, SEC, …. exp. Frakcionace II. Protein 1D frakce 2D frakce RP Protein 2D frakce digesce 1D (2D) HPLC ESI-MS/MS

19 LC separace komplexních proteinových směsí
Bi7050 LC separace komplexních proteinových směsí proteins peptides

20 off-line LC –MALDI Bi7050 Protein mix (proteins) (2 –D) LC CE
1. Depozice na MALDI target 2. Digesce na destičce off-line MALDI TOF/TOF

21 Kombinace GE a HPLC separace
1-D GE proteins peptides slices nano 1-D LC digesce ESI-MSMS protein fractionation nebo IPG strip často používané pro analýzu proteinových komplexů

22 Bi7050 2D-Off-line (3D ?) 2D-On-line
from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16, 3285–3303.

23 Bi7050 from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16, 3285–3303.

24 0. rozměr 1. rozměr 2. rozměr 3/4. rozměr
Bi7050 Celková analýza proteomu (screening) Depletovaná plazma (3500 – 9000 proteinů ??) 0. rozměr IEF (liq) 20 frakcí 1. rozměr LC (RP) 1600 frakcí 2. rozměr GE (1D/2D) ∞ frakcí 3/4. rozměr from H. Wang, Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4, 618–625.

25 Cílená analýza imunoafinitní frakcionace (Y(phos))
Bi7050 Cílená analýza imunoafinitní frakcionace (Y(phos)) from A.D. Zoumaro-Djayoon et al. / Methods 56 (2012) 268–274

26 Cílená analýza jednotlivých proteinů
Bi7050 Cílená analýza jednotlivých proteinů Parent mass Fragment mass CID Q1 Q3 Q2 Q1 „fix“ Q3 „fix“ kvadrupol Q1 i Q3 jsou nastaveny na vybrané hodnoty m/z (prekurzoru a vybraného fragmentu), zaznamenány jsou jen prekurzory, z kterých při fragmentaci v kolizní cele Q2 vzniká určený fragment během analýzy lze sledovat více reakcí (MRM) from K. Bluemlein et al. / Nature protocols 6 (2011) 859 –869

27

28 High throughput Bi7050

29 + Miniaturizace - chip technologie
Bi7050 + Miniaturizace - chip technologie

30 MS Charakterizace Modifikací
Bi7050 MS Charakterizace Modifikací Glyko Phos Ubiquitin ???

31 + y1 y2 y3 y4 y- ion serie + b1 b2 b3 b4 b- ion serie Bi7050
N-terminus C-terminus + y1 y2 y3 y4 y- ion serie + b1 b2 b3 b4 b- ion serie

32 Fragmentace peptidů – CID vs ETD
Bi7050 Fragmentace peptidů – CID vs ETD b, y c, z C-terminus (z- serie) CID ETD N-terminus (c-serie)

33 Proč analýza modifikací proteinů?
Bi7050 Proč analýza modifikací proteinů? Možnosti MS při analýze modifikací Druh Místo Úroveň

34 Mass shift Druhy modifikací: mutace (záměna AMK) chemické
Bi7050 Druhy modifikací: mutace (záměna AMK) chemické posttranslační Mass shift Užitečný přehled modifikací: DeltaMass ExPASy -

35 Mass shift „Chemické“ modifikace: Bi7050
záměrné modifikace (karbamidometylace Cys, N –terminal acetylace, PSD derivatizace, kvantifikační značky aj.) nechtěné modifikace (oxidace Met, deamidace N  D při purifikaci, adukty farmak) Mass shift

36 Common Posttranslational Modifications
Bi7050 Common Posttranslational Modifications Amines (K/N-terminus) Methylation Formylation Acetylation Lipoic acid Farnesylation Myristoylation Biotinylation Palmitoylation Stearoylation Geranylgeranylation Mass shift Acids & amides (E/D/Q/N) Pyroglutamic acid (Q) Deamidation (Q/N) Carboxylation (E/D) Hydroxyl groups (S/T/Y) Phosphorylation Sulphation Carbohydrates (S/T/N) Pentoses Deoxyhexoses Hexosamines Hexoses N-acetylhexosamines Sialic acid Další detaily:

37 MS Charakterizace mutací
Bi7050 MS Charakterizace mutací

38 Potvrzení výměny AMK na peptidové úrovni Protein: Zm-p60 (pozice 186)
Bi7050 Potvrzení výměny AMK na peptidové úrovni Protein: Zm-p60 (pozice 186) wild type NWLTFNEPQTFTSFSYGTGVFAPGR E186Q Q peptide mass difference: - 1 Da In-gel digesce MALDI-TOF MS Zm-p60.1 E186Q 2800 2810 2820 2830 m/z 300 400 500 600 700 800 900 1000 a.i. Zm-p60.1 wild type 1 Da

39 Identifikace výměny AMK na aminokyselinové úrovni
Bi7050 Identifikace výměny AMK na aminokyselinové úrovni Protein ve dvou variantách v jednom spotu na 2-D gelu Vstupní informace: Změna hmotnosti tryptického peptidu: –14 Da ... DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG MALDI-MS potvrzení změny hmotnosti daného peptidu (2 proteázy) MALDI-PSD nejednoznačné výsledky LC-MSMS nalezena mutace D/E v pozici 210 ... DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG

40 Bi7050 MSMS peptidu LSVTQSKPXTGEVIGVFES, MW (1992.0) m/z 956 m/z 970 „Modif“ MS2 (997.4, 2+) „Nemodif“ MS2 (1004.4, 2+) Rt (min) EIC chromatogram „Modif“ - detail MS/MS spektra 945.0 +MS2(997.4), 32.6min (#887) 300 1+ D 200 956.4 -14 927.2 100 m/z Ion b9 LSVTQSKPX D / E „Nemodif“ – detail MS/MS spektra 933.5 951.7 970.6 +MS2(1004.0), 32.1min (#878) 100 200 300 920 930 940 950 960 970 m/z E 1+ m/z

41 y8 y8 nederiv m/z 787.2 pro D y8 methyl m/z 829.3 pro D
Bi7050 LC-MSMS methylace, potvrzení D v pozici 210 po derivatizaci výměna H za CH3 na karboxy skupině tj. D = 14 Da/skupinu D, E a C-terminal pouze y8 y8 nederiv m/z pro D y8 methyl m/z pro D D = 42 Da VTQSKPX*TGE*VIG*

42 MSMS peptidu VTQSKPXTGEVIG před a po methylaci
Bi7050 MSMS peptidu VTQSKPXTGEVIG před a po methylaci m/z 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 [Abs. Int.] y8 787.7 y8 829.3 42 Da

43 MS Charakterizace modifikací
Bi7050 MS Charakterizace modifikací „chemické“

44 MALDI–MS spektrum digestů před a po modifikaci
Bi7050 MALDI–MS spektrum digestů před a po modifikaci (výřez spektra) nemodifikovaný peptid 2060 Peptid + X 2222 162 Da

45 MALDI–MS spektrum – Oxidace Met
Bi7050 MALDI–MS spektrum – Oxidace Met (výřez spektra) a.i. 1200 1100 1000 Sample prep artefact (Sypro Ruby) 900 16 Da 800 700 600 500 400 300 200 100 1256 1261 1266 1271 1276 m/z

46 Bi7050 Výsledek identifikace proteinu (Mascot) 1.    gi|     Mass: 13532    Score: 487    Queries matched: 5     50S ribosomal protein L14 [Escherichia coli O157:H7] Observed   Mr(expt)  Mr(calc)    Delta  Miss  Score    Peptide  ……. 939.45              (125)     MIQEQTMLNVADNSGAR 947.44                     MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) 947.45              (147)     MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) 955.45              (118)      MIQEQTMLNVADNSGAR + 2 Oxidation (M) D m/z 8 (16) ……. 16 (32) Jen část týkající se modifikovaného peptidu (Petra P. Vz. 3, )

47 Bi7050 LC-MS/MS 1x Ox 1x Ox 2x Ox EIC: m/z 939.5 (2+) m/z 947.4 (2+)

48 Bi7050 MS/MS spektrum nemodifikovaného peptidu - MIQEQTMLNVADNSGAR

49 y11 y10 MIQEQTMLNVADNSGAR b9 Bi7050 y10 – LNVADNSGAR b9 – M1IQEQTM7LN
y11 – M7LNVADNSGAR y10 y10 – LNVADNSGAR MIQEQTMLNVADNSGAR b9 – M1IQEQTM7LN b9 Posuny v m/z vybraných fragmentů pro jednotlivé případy M(ox) bez 1 Ox 2 Ox M1 M7 oba y10 y11 16 b9 32

50 Bi7050 + posun celé b serie (b3 - M1IQ) y10 1016,5 nemodifikovaný y11
1147,6 y10 – LNVADNSGAR y11 – M7LNVADNSGAR b9 1089,5 b9 – M1IQEQTM7LN y10 1016,5 + posun celé b serie (b3 - M1IQ) M1 - ox +16 y11 1147,6 b9 1105,5 y10 1016,5 M7 - ox +16 y11 1163,6 b9 1105,5 y10 1016,5 M1, M7- ox y11 1163,6 +32 +16 b9 1121,5

51 LC-MSMS spectrum (výřez spektra) …VC*AR
Bi7050 LC-MSMS spectrum (výřez spektra) Potrzení modifikace na Cys …VC*AR 200.4 246.4 285.5 314.9 384.0 410.5 441.4 455.9 468.1 493.3 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 4 x10 Intens. 200 250 300 350 400 450 500 m/z y3* y2 C + modifikace modifikace 200.3 246.1 268.1 285.4 300.0 315.3 349.3 383.3 410.1 428.2 448.2 478.5 522.2 1000 2000 3000 Intens. 200 250 300 350 400 450 500 m/z y4 y3 C y2

52 Bi7050 Histon H3, lokalizace acetylace (in-vitro)
MALDI-MS digestu (detail spektra) Bi7050 5340 Ac Ac ? 5382 Fragment with one E Ac two E Ac Non-acetylated fragment 250 500 750 1000 1250 1500 Intens. [a.u.] 5250 5300 5350 5400 5450 5500 5550 5600 5650 5700 5750 m/z

53 c14 c13 Bi7050 Histon H3, lokalizace acetylace K(14)
MALDI-ISD MS (detail spektra) ARTKQTARKSTGGKAPR c14 c13 Bi7050 T G K* 1246.4 c 11 1303.4 c 12 1360.4 c 13 1530.4 c 14 42 Da

54 Bi7050

55 Bi7050 Konec III. části