C7900 Lehká biotechnologie

Prezentace na téma: "C7900 Lehká biotechnologie"— Transkript prezentace:

1 C7900 Lehká biotechnologie
03.4 – Vitamin B12 Petr Zbořil

2 Vitamin B12 Struktura Část kobaltporfyrinová (korinoidní, faktor B)
Část nukleoidová (dimetylbenzimidazol, ribosa, P) Variace Ligandy Adenin místo DBI různě označovány

3 Vitamin B12 Struktura Část kobaltporfyrinová (korinoidní, faktor B)
Část nukleoidová (dimetylbenzimidazol, ribosa, P) Variace Ligandy Adenin místo DBI různě označovány

4 Vitamin B12 Význam Výskyt – izolace Resorbce – dávkování (ca 1 mg/den)
Biochemický – intramolekulární přesmyky, Oxidace MK, methioninový cyklus Fyziologický Perniciozní anemie Řada dalších, Alzheimer, nádorová onemocnění Výskyt – izolace Rybí vnitřnosti, kaly (ČOV), exkrementy přežvýkavcé Fermentační produjce – ca 15 t/rok Resorbce – dávkování (ca 1 mg/den) Potřeba vnitřního faktoru Další přenašeče

5 Vitamin B12 Resorbce – dávkování (ca 1 mg/den)
Potřeba vnitřního faktoru Další přenašeče

6 Vitamin B12 Vnitřní faktor Glykoprotein produkovaný žaludeční sliznicí
417 AK, 2 domény Komplex s kobalaminem

7 Vitamin B12 Biosyntéza Není zcela objasněna
Porfyrinová část – Gly, succ-CoA – 5-aminolevulinát Množství mikroorganizmů jej syntetizuje (bakterie, aktinomycety), významný výskyt ve výkalech přežvýkavců, aktivovaném kalu ČOV apod. 2 typy B12 – využitelný jen mikroorganizmem, druhý též živočichy

8 Vitamin B12 Biosyntetické dráhy Několik možností, podle mikroorganizmu
Různý výtěžek, zastoupení variant

9 Vitamin B12 Producenti – jediný způsob výroby
1948 – izolace ze Str. griseus (Rickets a kol.) Stovky fermentačních postupů a modifikací vyzkoušeny Pokusy o izolaci z kalů (USA) Produkce specifická – přímá Řada mikroorganizmů, různé dráhy (syntéza DBI x prekurzor Streptomyces olivaceus, Bacillus megaterium Propionibacterium feudenreichii, P. shermanii Produkce nespecifická – nepřímá Vedlejší produkt při výrobě antibiotik Streptomycety – streptomycin, grisein, aureomycin Genetické modifikace nespecifických producentů Zvýšení produkce kobalaminu při výrobě ATB

10 Vitamin B12 Důležité podmínky a vlivy
Není typický základní substrát (zdroj C) Většinou glukosa, též melasa Zdroj pro růst biomasy i B12, produkce je spojena s růstem Komplexní media Různé složení pro různé producenty Sojová mouka a olej, výpalky, rybí moučka, kasein apod. Další přídavky – anorganické soli – kovy Významná přítomnost Co Obecně vyšší koncentrace inhibují proces Nejlepší organické forma (kvasinky kultivované s Co – extrakt) Dostatečný obsah Co v některých surovinách – melasa, kukuřičný výluh – kontrola, doplnění

11 Vitamin B12 Důležité podmínky a vlivy – obecně Vzduchování Sterilizace
Nezbytné, vliv na kvalitu (mírné, 90 hod. – adenylkobamid, intenzivní, 70 hod. – benzimidazolylkobamid) Asi 0,5 obj./min., nebezpečí pěnění Sterilizace Důležitá, kontaminace sníží výtěžek až na 0,1 mg/L Nežádoucí účinky (vznik inhibitorů?) – výběr vhodného způsobu Cu2+ inhibují (zdroj materiál zařízení), pH  7 sníží jejich produkci Teplota 28 oC (21 – 34) pH Produkce kyselin, pH-stat, ca 7 Vlastní procesy často předmětem utajení

12

13 Vitamin B12 Fermentační výroba – Streptomyces olivaceus Propagace
0,5% glukosa, 0,5% (sušina) kukuřičný výluh, 2 ppm CoCl2, 0,1% sojový olej, pH 7,0 Sterilizace 60-90min. Při 120 oC, 48 hod. při 28 oC za třepání Produkce 1% glukosa, 0,9 ppm CoCl2, 2% sojová mouka, 0,1% sojový olej, 0,5% CaCO3, pH 7,0 Inokulum 1 – 5% (malý vliv), vzduchování, kompenzace pH , doba ca dnů, ca 3mg/L

14 Vitamin B12 Fermentační výroba – Propionibacterium freundenreichii
Fakultativní anaerob Auxotrofie na některé růstové faktory Produkční podmínky Vliv vzduchování – anaerobně produkce pomalá, ale plynulá, aerobní rychlejší, roste pH, pak ubývá produktu a buňky lyzují Pozitivní přídavek laktátu, optimálně s glukosou Symbiosa s mléčnými bakteriemi (L. casei)

15 Vitamin B12 Fermentační výroba – Propionibacterium freundenreichii
Produkční půdy – podle způsobu kultivace Kys. mléčná 2%, glukosa 0,2% - samotné P. f. Laktosa (syrovátka) – P. f. + L. casei, pak 1% kys. mléčné Melasa Ředění, úprava pH 5% kukuřičného extraktu, 10% obilných výpalků Přítokové kvašení Rozkvašení v nízkých koncentracích substrátu Po 48 hod. přídavky kontinuálně nebo dávkami po 12 hod. Využije 2x vyšší koncentraci sacharidu

16 Vitamin B12 Fermentační výroba – Propionibacterium freundenreichii
Přítokové kvašení Rozkvašení v nízkých koncentracích substrátu Po 48 hod. přídavky kontinuálně nebo dávkami po 12 hod. Využije 2x vyšší koncentraci sacharidu Kontinuální fermentace Dvoufázový způsob – dva fermentory Anaerobní – syntéza faktoru B Aerobní fáze – prekurzorování 5,6-dimetylbenzimidazolem

17 Vitamin B12 Izolace Obecný postup – schéma
Ukončení fermentace před rozpadem mycelia a destrukcí Variace dle účelu – léčivo, přísada do krmiva apod. Oddělení mycelia – krmivo, zpracování filtrátu Obecný postup – schéma Uvolnění – reakce s KCN – 1 hod. při 60 – 80 oC Adsorpce – C, bentonit, katex Desorpce – alkoholy, pyridin, vodný roztok NaCN Extrakce – fenol+butanol, CHCl3, krezol Rafinace adsorpční nebo IE chromatografií Zahušťovací kroky, okyselení aj. alternativní operace

18 Vitamin B12 Izolace – příklad
40 g KCN/100 L media, pH 8, 1 hod., pH 5, 2 hod., var, filtrace přes křemelinu Filtrát + C s křemelinou (2:1), filtrace, koláč promýt 9% fenolem Eluce 60% acetonem, další 90% fenolem, eluáty zahustit Extrakce butanolem s 33% síranu amonného Filtrace přes křemelinu, extrakce zřeď. HCl, pH 3 Zhuštění, extrakce fenol-benzen (1:2), promytí NaHCO3 Srážení aceton+eter (1:20), načervenalá sraženina Rozp. v etanolu, sražení vodou, příp. rekrystalizace z vodného acetonu

19 Vitamin B12 Děkuji za pozornost