C7900 Lehká biotechnologie

Prezentace na téma: "C7900 Lehká biotechnologie"— Transkript prezentace:

1 C7900 Lehká biotechnologie
10 – Organická rozpouštědla Petr Zbořil

2 Osnova prezentace Produkce organických rozpouštědel a dalších látek pro chemický a farmaceutický průmysl. Butanol a aceton - ABE, 2,3-butandiol - BDL, glycerol. Některé řazeny k výrobám biopaliv, zde je hlavním etanol (není součástí sylabu).

3 Butanol-aceton Produkce butanolu a acetonu (+ etanol) ABE Historie
1911 objev ABE kvašení – Fernbach 1916 vypracován fermentační postup – Chaim Weizmann Surovinou škrob

4 Butanol-aceton Užití Aceton pro výrobu výbušnin – WWI
Butanol pro letecký petrolej a syntetický kaučuk– WWII Konkurence petrochemie Nově butanol jako biopalivo, lepší než etanol – renesance biobutanolu

5 ABE Metabolický základ produkce Bakterie rodu Clostridium – anaerobní
Hlavní a vedlejší dráhy Tok materiálu podle druhu mikroorganizmu, kvantitativní rozdíly Zúčastněné enzymy – přenos genů Bakterie rodu Clostridium – anaerobní C. butylicum, C. acetobutylicum aj. – dle substrátu apod. Heterofermentativní – BuOH, aceton, HAc, EtOH, butyrát, 2-propanol Další produkty – CO2, H2 Mutace a selekce, genové manipulace

6 ABE Hlavní cesty – obdoba ketogeneze Další produkty, meziprodukty
Hexosy (pentosy) – CH3COCH2CO~SCoA CH3CH(OH)CH2CO~SCoA – CH3CH2=CH2CO~SCoA CH3CH2CH2CO~SCoA – CH3CH2CH2CHO – CH3CH2CH2CH2OH HMG~SCoA – CH3COCH2COOH – CH3COCH3 (CH3CH(OH)CH3 u C. butylicum) Další produkty, meziprodukty Fermentace prochází různými stadii, mění se složení, převládají typické produkty (kyseliny octová a máselná, plyny)

7 ABE Metabolické cesty produkce

8 ABE Metabolické cesty produkce

9 ABE Fáze produkce, chybí plyny

10 ABE Suroviny Typy produkce Mnoho přírodních využitelných substrátů
Škrob – Weizmannův typ Sacharosa – sacharotyp Další – testované Mnoho přírodních využitelných substrátů Topinambury, jablečná dřeň, syrovátka … Hemicelulosy

11 ABE Suroviny – možné substráty

12 ABE Suroviny Škrobnaté materiály – brambory, kukuřice, obilí
Vhodné pro C. acetobutylicum, má amylasu Úprava strouháním, drcením, sterilizace Většinou soběstačné co do ostatních nutričních faktorů Melasa, sulfitové výluhy Jiná Clostridia Nutná úprava a dodatkové živiny

13 ABE Úprava surovin Melasa
Obtížněji se fermentuje, obsahuje inhibitory, chybí některé nutriční faktory Vhodná kombinace s obilnou surovinou (ca 10% hlavního tanku, nejlépe formou zákvasu), jinak přídavek výpalků Nutno přidávat NH4+ a bílkoviny (autolyzát kvasinek, kukuřičný výluh) Vhodné je předem invertovat sacharózu (4% H2SO4), úprava na pH 6,5-6,4

14 ABE Úprava surovin Sulfitové výluhy
Obsahují toxické látky (SO2, fural aj.), nutno odstranit propařením, srážením Ca(OH)2 apod. Chudé na důležité nutriční faktory Doplňují se zdrojem N, P a K, vhodná je kombinace s obilným zákvasem, klíčky apod.

15 ABE Fermentační postupy Úprava surovin, „upstream“ Vlastní fermentace
Podle typu, vybavení – drtič, pařák, síta, sterilizace Vlastní fermentace Periodická Bateriová Kontinuální – není zcela vyřešena Izolace, „downstream“ Extrakce Destilace

16 ABE Periodická fermentace Propagace Ca 5 L baňky
1 – 2 m3 předkvasná část 200 – 1000 m3 produkční fermentory Vybavení Potrubí a ventily spojovací, přepouštěcí mezi tanky, odvod plynů, pojistný ventil, přívod media, zákvasu, sterilních plynů, očkovací tubus, vzorkovací kohout Termostat, chlazení, míchadlo, tlakoměr

17 ABE 2 stadia (4 fáze) periodické fermentace
Acidogeneze a solventogeneze Fáze 1 – zvyšování kyselosti – ca hod. Lag a začátek log-fáze, minimum pH, titrační kyselost ještě 2-3 hod. roste (kys. máselná a octová), vývoj plynů, žádné spory Fáze 2 – maximální kyselosti a zvratu – ca 2 hod. Produkce plynů stagnuje, stoupá rychlost produkce ABE, žádné spory Fáze 3 – snižování kyselosti a tvorba ABE – ca 14 hod. Pokles kyselosti, pH roste jen málo (pufrováno bílkovinami), intenzivní tvorba ABE, rychlý pokles škrobu, vzácně spory Fáze 4 – dokvášení – ca 4-6 hod. Nepatrné zvýšení titrační kyselosti, pH se nemění, vývoj plynů i ABE ustává, sacharidy mizí, sporulace, autolýza buněk Celková doba hod. podle podmínek (konc. sacharidu)

18 ABE Periodická fermentace

19 ABE Produkty fermentace ABE ca 3:6:1 Plyny – CO2 a H2
Molární poměry, stechiometrie Plyny – CO2 a H2 Čisté, využití pro výrobu suchého ledu, hydrogenace (ztužování tuků), výroba NH3, palivo Biomasa po úpravě jako krmivářská surovina

20 ABE Důležité podmínky a vlivy
Nutnost sladit přípravu produkčního media když je zákvas ve 2. fázi – přítok samospádem, skleněné potrubí Probublávání CO2 k odstranění O2 Konc. sacharidů 5-7%, vyšší neúměrně prodlužují proces Tepelné optimum ca 37 oC Optimální pH 5-7,2 podle producenta (technologie) Inhibice kovy (Cu) i stimulace (Fe) – materiál zařízení Butanol začíná inhibovat od 0,2%, max. produkt 3% Hledání rezistentních kmenů zatím neúspěšné

21 ABE Problém mikrobiální kontaminace
Mléčné bakterie, jiné klostridie, bakteriofág Nedostatečná sterilizace, kontaminace netěstsnostmi Nutný přetlak (využití kvasných plynů z paralelních tanků na začátku) Konkurence o substráty – jiné produkty, problémy s izolací ABE Fág likviduje produkční kmen

22 ABE Bateriová fermentace Baterie fermentorů, 1. aktivátor
Inokulum a medium v aktivátoru hod. pak postupné přečerpávání, aktivátor se doplňuje mediem ke zbytku zákvasu. Koncový tank se vyprazdňuje první, vyčistí, zakvasí a vše jde zpět. Trvání ca 42 hod.

23 ABE Izolace frakční destilací
Různá uspořádání, propojení rektifikačních kolon s deflegmátory a dekantéry Značné rozdíly b.v. usnadňují frakcionaci Omezená misitelnost butanolu s vodou – dekantace

24 ABE Produkce ABE na kukuřičném škrobu

25 ABE Produkce ABE na melase

26 ABE Výtěžky a ztráty – podle technologie odchylky
Ca 36% škrobu se přemění na ABE, tvoří ca 2% media Vyšší výtěžky pro hydrolyzáty hemicelulos Ztráty 4-10% Odpařováním – kvasné plyny, destilace, přečerpávání Vedlejší produkty ca 36 m3 CO2 a 24 m3 H2/100 kg škrobu Složení kvasných plynů kolísá během procesu – fáze Dělí se promýváním (věž) Bezpečnostní problematika Páry ABE, vodík Elektrická instalace, povrchy – plasty (elstat. výboje)

27 ABE Bilance materiálu

28 ABE

29 2,3-BDL Metabolický základ produkce
Společná cesta z glukosy k pyruvátu Odlišnosti u různých mikroorganizmů Kvasinky přes acetoin redukcí Bakterie přes acetolaktát, acetoin a diacetyl Odlišnosti též co do vedlejších produktů Glycerol, formiát, vodík

30 2,3-BDL

31 2,3-BDL Kvasinky Bakterie
2 CH3CO.COOH CH3CH(OH).CO.CH CH3CH(OH).CH(OH).CH3 (TPP), - 2CO acetoin NADH ,3-butandiol Bakterie 2 CH3CO.COOH CH3CO.C(OH).COOH CH3CH(OH).CO.CH3 (TPP), - CO CH CO2 acetolaktát CH3CO.CO.CH CH3CH(OH).CH(OH).CH3 diacetyl

32 2,3-BDL Stereoisomery BDL

33 2,3-BDL Mechanizmy tvorby stereoizomerů 2,3-BDL

34 2,3-BDL Producenti

35 2,3-BDL Producenti Aerobacter aerogenes Bacillus polymyxa
Fermentuje většinu monosacharidů i rafinosu, alkoholy, aerobní Bacillus polymyxa Má amylasu, fermentuje i škrob Za anaerobních podmínek produkuje též glycerol Bacillus subtilis Nemá amylasu Serratia marcescens Substrát glukosa, aerobní podmínky Další produkty – formiát, acetát, laktát, etanol

36 2,3-BDL Suroviny Škrobnaté po hydrolýze (mimo B. polymyxa) Cukernaté
Obilí + 1% CaCO3 Cukernaté Melasa – přídavek fosfátu a výluhu sladových klíčků Sacharosa + 1% CaCO3 + otruby Cukrovka, třtina (Před)hydrolyzáty dřeva, sulfitové výluhy Pentosany Standartní úpravy

37 2,3-BDL Fermentační zařízení Vybavení podobné jako u ABE kvašení
Navíc vzduchování U škrobnatých surovin separátor nerozpustného podílu

38 2,3-BDL Fermentační proces pro A. aerogenes Propagace Průběh kvašení
500 ml na vhodné sterilní půdě (melasa+fosfát+kvasničný autolyzát) – 24 hod., aerace 50 L propagátory, 48 hod. Produkční tanky – 1 – 10 m3, Průběh kvašení 14 – 16 hod. vzduchování, pak každých 5 hod. 10 min. vzduchování, jinak anaerobně (míchání) Celková doba ca 100 hod.

39 2,3-BDL Podmínky a vlivy Koncentrace cukru až 20%, vznikají však vedlejší produkty, lépe začít s 10% (i méně) a zbytek přítokem nebo v dávkách během fermentace Produkce stereoizomerů závisí na mikroorganizmu A. aerogenes – 5-14% L-, zbytek mezo- B. polymyxa – 98% i více D- B. subtilis – kolem 40% D- zbytek mezo- S. marcescens – až 100% mezo- Vzduchování ovlivňuje absolutní výtěžky i zastoupení vedlejších produktů (acetoin, etanol)

40 2,3-BDL Podmínky a vlivy Vzduchování ovlivňuje absolutní výtěžky i zastoupení vedlejších produktů (acetoin, etanol) pH ovlivňuje rychlost, výtěžky i zastoupení produktů Optimum se určuje pro každý proces laboratorně Živiny Přirozené suroviny není třeba přiživovat (obilí, brambory, řepa) Melasa – přídavek jak uvedeno, podle mikroorganizmu Přidání P, K, Mn – příznivý vliv Mo, Co, i Mn – snižují BDL, zvyšují produkci etanolu Podle producenta

41 2,3-BDL Produkce stereoizomerů BDL
GM E.coli - optimalizace produkce, podobně u ABE

42 2,3-BDL Izolace, v médiu 3-4% BDL, b. v. 184 oC Oddestilování etanolu
Filtrace, zahuštění (vakuová odparka) na 15% BDL Extrakce vodní parou ve vakuu Eventuality Esterifikace kys. octovou (katalyzovaná kys. sírovou), oddestilování esteru, termický rozklad na butadien Extrakce rozpouštědly – eter, butanol aj., lze regenerovat

43 2,3-BDL 1- fermentor, 2 – 2fázová extrakce s vodou, 3 – regenerace soli, 4 – odparka (stékající film), 5 – rektifikační kolona, 6 – kolona zachycení metanolu

44 2,3-BDL Srovnání separačních technik BDL

45 2,3-BDL Využití Rozpouštědlo Nemrznoucí směsi
Plasty, umělý kaučuk – butadien

46 Glycerol Možnosti Zbytek při průmyslovém zpracování tuků
Výroba mýdel – hydrolýza tuků na MK + glycerol Chemická syntéza Chlorace propenu na triCl-propan, hydrolýza Fermentační produkce Složitější, využívaná pro zpracování odpadů nebo při limitaci jiných způsobů Způsoby využívány podle užitečnosti, možností, dostupnosti surovin apod. Válečné podmínky, požadavek x snížená dostupnost olejů

47 Glycerol Metabolický základ Varianta etanolového kvašení
I při výrobě etanolu se produkují ca 3% glycerolu v zápaře Přesměrování metabolitů NADH pro redukci DHAP místo acetaldehydu Zábrana redukce acetaldehydu Siřičitanový způsob CH3CHO + HSO CH3CH(OH). SO3- Alkalický způsob 2 CH3CHO CH3CH2OH + CH3COOH

48 Glycerol Produkce

49 Glycerol

50 Glycerol

51 Glycerol Producenti Bakterie Kvasinky S. cerevisiae, S. carlsbergensis
Závisí na druhu substrátu, liší se produkcí (20-28% glycerol) Nemnoží se během fermentace, část hyne, ostatní botnají Adaptací se zvyšuje odolnost, znovu použité mají jen 15-20% úhyn Lze pak zvýšit konc. siřičitanu  vyšší výtěžky glycerolu Bakterie B. subtilis, více vedlejších produktů

52 Glycerol Suroviny Cukernaté Škrobnaté
Čistá sacharosa, nejlepší, čistý produkt Ostatní zkvasitelné cukry Melasa – nevýhodou obsah aminosloučenin (AK, betain), tmavé produkty reakcí s invertním cukrem, přechází do glycerolu. Je levná, užívá se podle nároků na produkt. Škrobnaté Nutná hydrolýza, kyselá nebo enzymová Důležité přečištění, balasty přecházejí do glycerolu

53 Glycerol Fermentace – siřičitanový způsob
Kvasinky představují komplex enzymů, nemnoží se Nutno dodávat větší množství, vyzkoušet adaptabilitu Suspenze lisovaného droždí ve vodě, přídavek zředěného roztoku siřičitanu a živin, inkubace ca 2 hod. – adaptace Zakvašení produkčního tanku 14% sacharosa (melasa), hydrogenfosfát amonný, MgCl2, siřičitan do 20% koncentrace Po hod. se zákvas odtáhne ke zpracování

54 Glycerol Podmínky a vlivy Modifikace produkční fáze
Prokvašené medium se dekantuje, odčerpá se ca 60%, centrifugací se separují kvasinky, vrací se do fermentace Doplní se sacharosa, kvasinky a siřičitan Rychlé kvašení (i 7-9 hod.) Úspora 60-75% droždí a 33% siřičitanu Lze opakovat 5-6 Jinak – namnožení adaptovaných kvasinek, užití výpalků ke zřeďování melasy místo vody aj. Teplota optimálně oC

55 Glycerol Podmínky a vlivy
Konc. sacharidu 12-14%, fermentace trvá do 30 hod. Vliv siřičitanu Produkce glycerolu efektivně roste do ca 20% siřičitanu (ca 25-30% výtěžek glycerolu vzhledem k cukru), pak již podstatně méně – nevyplatí se Koroze materiálu zařízení, nevhodné Fe, lépe Cu, Al, sklo, nerez Provzdušňování nemá vliv na proces, působí jako míchání, inhibuje sirné bakterie Kontaminace Bakterie zužitkovávající glycerol (E. coli, A. aerogenes aj.) Sirné bakterie (Desulfovibrio), produkce sulfidů, provzdušnění zabrání redukci siřičitanu

56 Glycerol Fermentace v alkalickém prostředí
5% Na2CO3 nebo K2CO3 příp. hydroxidy Více zastoupen etanol, je čistší (po destilaci) Delší doba kvašení, 4-5 dní Méně efektivní

57 Glycerol Izolace Centrifugace – kvasinky lze znova užít (ev. regenerace) Destilace – oddělení etanolu (příp. zachycení CH3CHO při dobrém chlazení), není dost čistý pro rafinaci Čeření (0,1% CaO), dekantace a filtrace (pevná fáze Zahuštění filtrátu a krystalizace siřičitanu – znovu se užije 16-20% glycerol, opětné čeření, zahuštění a krystalizace 60% glycerol, destilace s vodní parou (15-30 torr) Rafinační destilace

58 Děkuji za pozornost