C7900 Lehká biotechnologie

Prezentace na téma: "C7900 Lehká biotechnologie"— Transkript prezentace:

1 C7900 Lehká biotechnologie
12 – Ketonické kvašení Petr Zbořil

2 Osnova prezentace Ketonické kvašení, charakteristika, metabolity.

3 Ketonické kvašení Podstata – speciální případ tvorby ketoskupiny  
  Oxidace CH(OH) na C=O Specificita erythro-, threo- Patří sem i konverze sorbitolu na L-sorbosu Viz výroba kys. askorbové

4 Ketonické kvašení Ketoglukonové kyseliny CHO Pseudomonas HCOH HOCH GOx
HCOH Acetobacter H2COH

5 Ketonické kvašení Kyselina 2-ketoglukonová
Producent – Pseudomonas fluorescens Fermentační medium Pro všechny propagační stupně 10% glukosa, 3% CaCO3, KH2PO4, močovina, MgCl2 Podmínky a vlivy Intenzivní vzduchování T 30 oC Doba fermentace hod., kontrola substrátu, po vyčerpání glukosy katabolizuje produkt

6 Ketonické kvašení Kyselina 5-ketoglukonová
Producent – Acetobacter suboxydans Fermentační medium Pro všechny propagační stupně 10% glukosa, 3% CaCO3, 0,25% kvasničný autolyzát Dvoufázová produkce Logaritmická fáze, produkce kys. glukonové, vyčerpání glukosy Růst ukončen, oxidace na 5-ketoglukonát

7 Ketonické kvašení Kyselina 5-ketoglukonová Podmínky a vlivy
Intenzivní vzduchování T oC, zvýšení vede k produkci 2-ketoglukonátu jako vedlejšího produktu Doba fermentace ca 30 hod.

8 Ketonické kvašení Izolace produktů – obě ketokyseliny
Vysrážení jako Ca-soli v mediu, centrifugace Sraženina se rozpustí v HCl, filtrace nerozpustných balastů Filtrát se přečistí karborafinem, odstranění rozpuštěných nečistot Srážení NH4OH Využití v chemickém průmyslu, oxidací (V2O5) vzniká kys. vinná

9 Ketonické kvašení Fenylacetylkarbinol, efedrin

10 Efedrin Historie Získávání Izolován z čínské drogy Ma-Huang, 1885
Později z Ephedra vulgaris, roste v jižní Evropě, Asii i Africe, obsah 2 – 3% Získávání Izolace z přirozeného materiálu Malá produkce, vyšší potřeba Organická syntéza Fermentační technologií

11 Efedrin Historie Získávání izolován z čínské drogy Ma-Huang, 1885
Později z Ephedra vulgaris, roste v jižní Evropě, Asii i Africe, obsah 2 – 3% Získávání Izolace z přirozeného materiálu Malá produkce, vyšší potřeba Organická syntéza Efektivní, problém stereoselektivity Fermentační technologií

12 Získávání fermentační technologií
Produkce L-fenylacetylkarbinolu (L-(-)-1-fenyl-1-hydroxy-2-propanon, L-PAC) Organická substituce na efedrin

13 L-PAC Schema biosyntézy Aktivní acetaldehyd glukosy (sacharidu)
Přídavek acetaldehydu Benzaldehyd jako prekurzor Aldolová kondenzace

14 L-PAC Schema biosyntézy Aktivní acetaldehyd glukosy (sacharidu)
Přídavek acetaldehydu Benzaldehyd jako prekurzor Aldolová kondenzace Analogie s butandiolem

15 Ketonické kvašení Fermentace Producent Substráty
Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergesis Testovány jiné, sporadicky Substráty Sacharidy Sacharosa čistá, melasa Glukosa Prekurzory Benzaldehyd Acetaldehyd (akceptor elektronů?)

16 Ketonické kvašení Fermentace Průběh
Jednostupňový proces, koupené droždí Přídavek prekurzoru po adaptaci Obdoba glycerolu Opakované užití, méně aktivní, nutnost regenerace Dvoustupňový, nejprve nárůst biomasy (vyčerpání sacharidu), pak masivní přídavek nového sacharidu a prekurzoru Podmínky pro Crabtreeův efekt – vysoká konc. glukosy, anaerobní cesta v aerobním prostředí

17 L-PAC Příklad fermentace Ukončení po 12 hod.
50g melasy, 20g sacharosy, 0,4g MgSO4, 0,9g H3PO4 v 1 L, pH 4,9 – 5,5 Suspenze promytých kvasinek ve vodě s 5% sacharosy Rozkvašení 1 hod., přídavek benzaldehydu přítokem po 8 hod., konc. do 1% Ukončení po 12 hod. Spotřebuje okolo 4 % cukru a 1,25 až 1,4 % benzaldehydu Na konci biotransformace se ve větší míře objevuje benzylalkohol (až 0,25 %) a etanol (až 2 %)

18 L-PAC Izolace Kvasinky se oddělí (separátor, filtr), opakovaná (resp. protiproudá) extrakce media (eter, butylacetát), vysušení, filtrace, zahuštění Surový produkt + vedlejší produkty (benzylakohol aj.) Ca 50% L-PAC, olejovitý produkt

19 L-PAC L-Efedrin Katalytická reduktivní aminace
Metylamin, plynný vodík, zvýšený tlak a teplota Katalyzátoru (platinová čerň na nosiči) Vedlejší produkty (D-(+)-efedrin a L-(-)- a D-(+)-pseudoefedrin) – čištění, krystalizace, efedrin.HCl.

20 L-PAC Izolace Kvasinky se oddělí (separátor, filtr), opakovaná (resp. protiproudá) extrakce media (eter, butylacetát), vysušení, filtrace, zahuštění Surový produkt + vedlejší produkty (benzylakohol aj.) Ca 50% L-PAC, olejovitý produkt

21 L-Efedrin Výhodou fermentace je vysoká stereoselektivita, vysoký výtěžek žádané L-(-)-formy Užití Léčba alergických stavů – astma, oběhových poruch Yastyl – průdušky, údajně návykový Problémy zneužití – Pervitin

22 L-PAC Fenmetrazin – stimulans, anorektikum Léčivo – droga

23 L-PAC Vývoj a optimalizace nových postupů Prekurzorování
Imobilizované systémy Užití izolovaných enzymů – pyruvát DH Mutace a GMO

24 L-PAC Prekurzorování Patenty pracovišť v ČSSR – prekurzorování acetaldehydem

25 Ketonické kvašení c

26 L-PAC Vliv složení media – C. utilis Přítomnost neidentifikovaných
stimulátorů v melase

27 L-PAC Vliv koncentrace benzaldehydu

28 L-PAC Vliv dávkování benzaldehydu

29 Užití izolovaných enzymů – pyruvát DH

30 Ketonické kvašení Kyselina koji

31 Koji Produkt plísně Aspergillus oryzae Asijské potravinářství
Tradiční výroba fermentací surovin Omáčky, ryby, rýže – saké Označení koji – produkty i plíseň Izolace – K. Saito, 1907

32 Koji Kvašení saké A. oryzae

33 Koji A. oryzae na rýži

34 Koji Biosyntéza Glukosa (hexosy, di- až polysacharidy) Pentosy
Rozdílné cesty podle producenta Glukosa (hexosy, di- až polysacharidy) Dehydrogenace a dehydratace Pentosy Přes 2- a 3-C metabolity (mohou být též substráty)

35 Koji - 2 (H) - 2 H2O

36 Koji Producenti Suroviny – sacharidy
Plísně – Aspergillus oryzae, A. niger, Penicillium Bakterie – Acetobacter, Gluconobacter Využívají jiné sacharidy Suroviny – sacharidy především hexosy – glukosa (sacharosa, maltosa) Jiné – pentosy, glycerol, dihydroxyaceton (meziprodukty)

37 Koji Fermentace Podmínky a vlivy Medium - příklad Průběh
2% glukosa, 0,25% KH2PO4, po 0,1% MgSO4, KCl, NH4NO3, úprava na pH 5, zaočkování sporami A. niger Průběh 8 – 15 dní při 30 oC za silné aerace, pokles pH na ca 2,5 – ihned izolovat (metabolizuje se) Podmínky a vlivy pH optimální produkce při 2,2 – 3, růst při 5 Důležitý fosfát jako živina i pufr Nevhodné komponenty N jako kvasničný extrakt či kukuřičný výluh zvyšují růst na úkor produkce

38 Koji Izolace Odfiltrování mycelia
Zahuštění filtrátu – krystalizace za chladu (ev. rekrystalizace)

39 Koji Užití Průmysl, chemikálie Potravinářství a kosmetika Terapie
Chelatační činidlo, barviva, lokální anestetika Potravinářství a kosmetika Bělicí účinky – ovoce, pleťové krémy (krásné ruce výrobců saké) – vedlejší účinky – alergie, podráždění pokožky … Terapie Radioprotektant Zesiluje cytostatické účinky kvercetinu

40 Koji Užití

41 Koji

42 Koji Užití Vedlejší účinky

43 Děkuji za pozornost