Elektromigrační metody. Podstata „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“

Prezentace na téma: "Elektromigrační metody. Podstata „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“"— Transkript prezentace:

1 Elektromigrační metody

2 Podstata „Pohyb elektricky nabitých částic v elektrickém poli“

3 Historický přehled 1880 - první elektroforetické separace Smirnow,Hardy 1897 - regulační frunkce Kohlrausch 1930 - volná elektroforéza Tiselius (1948 Nobelova cena) 1962 - izoelektrická fokusace Vesterberg, Svensson 1967 - kapilární elektroforéza v rotující 1 - 3 mm křemenné kapiláře Hjerten 1970 - SDS PAGE Laemmli 1975 - 2D-elektroforéza O´Farrell 1976 - isotachoforéza Everaerts, Mikkers

4 Teoretické aspekty elektromigračních metod

5 Mobilita

6 E = intenzita elektrického pole [V/m] Q = náboj částice = z i  e [] Elektrická síla F e Frikční síla F f v = rychlost částice f(frikční koeficient) = 6 . .r

7 [m -2 V -1 s -1 ] Ustálený stav mobilita

8 Sekundární jevy Jouleovo teplo Elektroosmóza

9 Jouleovo teplo P = výkon [W.m -3 ] S = průřez [m 2 ]  = vodivost [  -1.m -1 ] i = elektrický proud [A]

10 Elektroosmotický tok

11  = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy  = viskozita  = dielektrická konstanta  eo = elektroosmotická mobilita

12 Původ elektroosmotického toku

13 Elektroforéza „Dělení nabitých částic na základě rozdílných elektroforetických mobilit“

14 Elektroforéza Volná Zónová

15 Volná elektroforéza ++ -- C B+C A+B+C A A+BA+B  A >  B >  C

16 Zónová elektroforéza + + A+B+C A B C - -  A >  B >  C

17 Stabilizace Rotací Gradienty hustoty Porézními medii Kapilárou

18 Požadavky na porézní media Homogenita Inertnost - nespecifické interakce - nulový EOF Reprodukovatelná a snadná příprava Mechanická pevnost transparentnost

19 Upořádání Horizontální + -

20 + - Upořádání Vertikální

21 Chromatografický papír Složení – celulosa -Nehomogenní -Přítomnost ionogenních skupin -Špatně se chladí – pálí se Použití : téměř už se nepoužívá

22 Agar a agarosa Složení – kopolymer galaktosy a anhydrogalaktosy -Přítomnost ionogenních skupin – silný EOF + Velké pory + Snadná příprava Použití : imunoelektroforetické metody elektroforéza NK

23 Acetát celulosy Složení – acetát celulosy + Komerčně dostupný + Dobré mechanické vlastnosti Použití : imunoelektroforetické metody klinické aplikace

24 Škrob Složení – hydrolyzovaný škrob + poprvé se uplatňuje efekt molekulového síta -Špatné mechanické vlastnosti -Komplikovaná a nereprodukovatelná příprava -Není transparetní Použití : izoenzymová analýza

25 Sypané vrstvy Složení – Sephadex – zesíťovaný dextran + uplatňuje efekt molekulového síta Použití : preparativní

26 Polyakrylamid Složení – kopolymer akrylamidu a N,N,- methylenbisakrylamidu + plně splňuje požadavky -Monomery jsou neurotoxiny !!!!!! Použití : analýza bílkovin

27 Polyakrylamid

28 Polyakrylamid - příprava Radikálová polymerace Katalyzátor – tetramethylethylendiamin TEMED Iniciátor - chemicky – (NH 4 ) 2 S 2 O 8 - fotochemicky – ribloflavin + UV

29 Polyakrylamid - složení a – akrylamid (g) b – methylenbisakrylamid (g) m – objem (ml)

30 Fergussonova rovnice PAGE není pouze pasivním nosičem, ale podílí se na separaci efektem molekulového síta.  - mobilita  0 - mobilita při limitním zředění K r – retardační koeficient

31 T  T  T  A B Mr A = Mr B pI A  pI B Uplatnění Fergussonovy rovnice A B Mr A  Mr B pI A  pI B Mr A  Mr B pI A = pI B A B

32 Provedení PAGE vertikální x horizontální deskové x trubičkové homogenní x gradientové kontinuální x diskontinuální

33 Provedení PAGE

34

35 Diskontinuální PAGE Orstein, Davis Koncentrační gel T = 3 – 5 % Separační gel T = x % Elektrodový pufr Tris Glycin pH 8.3 Koncetrační pufr Tris HCl pH 6.8 Separační pufr Tris Glycin pH 8.3 Elektrodový pufr Tris Glycin pH 8.3 Cl - Gly - B-B- A-A- Cl - Gly - B-B- A-A- Separační gel Zónová elektroforéza Koncentrační gel Izotachoforéza + -

36 SDS PAGE + 1 g bílkoviny váže 1.4 g SDS  uniformní náboj na jednotku MW

37 SDS PAGE

38 Stanovení Mr pomocí SDS PAGE Mr Rm

39 Stanovení Mr pomocí SDS PAGE - standardy

40 Použití SDS PAGE Stanovení Mr Analýza komplexních směsí Sledování purifikace bílkovin Stanovení podjednotkového složení + - + - + -

41 PAGE - sekvenace DNA

42 Kapilární zónová elektroforéza CZE

43 Módy CZE

44 Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře

45 Výsledná mobilita částic při CZE

46 Separace aniontů pomocí CZE

47 Princip MEKC Micela a – střed – rozpustná v obou b – silně hydrofilní – nerozpustná v micele c – silně hydrofóbní – nerozpustná ve vodné fázi

48 Micelární elektrokinetická chromatografie

49 Separace fenolů a alkoholů pomocí MEKC

50 Kapilární gelová elektroforéza

51 CGE fragmentů dsDNA

52 Instrumentace CZE

53 Schéma zařízení pro CZE

54 Napájecí zdroj stabilizovaný ± 30 kV 300 μA konstantní napětí nebo proud obojí polarita ochrana obsluhy

55 Kapilára křemenná - 25 -100 μm i.d - 350 μm o.d. délka až 100 cm délka polyimidové vnější pokrytí

56 Dávkování - hydrodynamické

57 Dávkování - elektrokinetické

58 Detekce spektrofotometrická

59 Detekce fluorescenční

60 Izoelektrická fokusace „Elektroforéza v gradientu pH, částice jsou separováný podle svých pI“

61 Tvorba gradientu Anoda (+) H 3 O + 6H 2 O  O 2 + 4H 3 O + + 4 e - Katoda (-) OH - 4H 2 O  2H 2 + 4OH - - 4 e - Ampholyty

62 Izoelektrická fokusace pH + - H3O+H3O+ OH - A + - H3O+H3O+ A pI t0t0 t1t1

63 Izoelektrická fokusace + - H3O+H3O+ OH - pH txtx

64 Kapilární izoelektrická fokusace

65 Izoelektrická fokusace analytická Provedení - v gelech – PAGE, agarosa Použití - sledování komplexních směsí - izoenzymové složení - stanovení pI – rozřezání a eluce –  pH elektrody – pI standardy

66 Izoelektrická fokusace analytická

67

68 Izoelektrická fokusace analytická - standardy

69 Izoelektrická fokusace preparativní Provedení - v sypaných vrstvách – Sephadex - v gradientech hustoty – sacharoza - rotací – Rotofor (BioRad) Použití – izolace bílkovin

70 Dvourozměrné metody Metoda titračních křivek Dvourozměrná elektroforéza

71 Metoda titračních křivek I.rozměr – IEF bez vzorku II.rozměr – elektroforéza se vzorkem pH 3.0 10.0 - - + + pH 3.0 10.0

72 Dvojrozměrná elektroforéza pI MrMr I.rozměr IEF II.rozměr SDS-PAGE pH 3.0 10.0

73 Dvojrozměrná elektroforéza

74 pI MrMr

75 Izotachoforéza „Vzorek je umístěn mezi dva elektrolyty : vedoucí L (leading) s nejvyšší mobilitou a - uzavírající T (terminating) s nejmenší mobilitou“

76 Izotachoforéza T A+BL T L BA B T ABL A B T L A B T L A t0t0 t1t1 t2t2 t3t3 + + + - - -

77 Izotachoforéza

78 IvIv  E LBAT  L >  A >  B >  T

79 Kohlrauschova regulační funkce

80 Analytická ITP + - Dávkování Detekce Zapisovač Napájení

81 Analytická ITP instrumentace Napájení - stejnosměrné 30 kV 0,2 – 0,5mA Kapilára 0,1 – 2 mm Dávkování - dávkovací ventil Detekce - universální – konduktometrická – potencialně gradientová - selektivní – UV-VIS

82 Analytická ITP Metoda spojování kapilár Předseparační kapilára – 2 mm Analytická kapilára – 0.1 mm

83 Izotachoforetický záznam kvantita A T L B

84 Izotachoforetický záznam kvalita A T L B

85 Preparativní ITP V gelech - Sephadex + -

86 Preparativní ITP - L A+B T A B + Kontinuální plošná

87 Detekce po elektroforéze a izoelektrické fokusaci

88 Nespecifická detekce

89

90

91 Fluorescenční detekce

92 Specifická detekce

93 Autoradiografie

94 Specifická detekce

95 Detekce glykoproteinů

96 Detekce na základě biologické aktivity

97

98 Blotting Southern – DNA Nothern – RNA Western - bílkoviny

99 DRŽÁK FILTRAČNÍ PAPÍR BLOTOVACÍ MEMBRÁNA GEL NÁDOBA S PŘENOSOVÝM PUFREM DRŽÁK HOUBA FILTRAČNÍ PAPÍR BLOTOVACÍ MEMBRÁNA Difuzní blotting

100 Vakuový blotting PORÉZNÍ PODLOŽKA VÝVĚVA ZÁKLADNA GEL FILTRAČNÍ PAPÍR BLOTOVACÍ MEMBRÁNA

101 Kapilární blotting ZÁVAŽÍ BLOTOVACÍ MEMBRÁNA FILTRAČNÍ PAPÍR NÁDOBA S PŘENOSOVÝM PUFREM FILTRAČNÍ PAPÍR GEL

102 FILTRAČNÍ PAPÍR KATODA DRŽÁK FILTRAČNÍ PAPÍR NÁDOBA S PŘENOSOV ÝM PUFREM DRŽÁK HOUBA + - ANODA BLOTOVACÍ MEMBRÁNA GEL Tankový elektroblotting

103

104 Tankový elektroblotting Mini Protean Trans Blot Cell

105 „Semi dry“ blotting FILTRAČNÍ PAPÍR + FILTRAČNÍ PAPÍR BLOTOVACÍ MEMBRÁNA KATODA ANODA - GEL

106 „Semi dry“ blotting

107 PORÉZNÍ PODLOŽKA VÝVĚVA NANÁŠECÍ ŠABLONA BLOTOVACÍ MEMBRÁNA TĚSNĚNÍ ZÁKLADNA JAMKY PRO NANÁŠENÍ VZORKŮ TĚSNĚNÍ Kapkovací dot blotting