Pokroky v moderních separačních metodách Hana Adamusová Metody pro analýzy estrogenů z životního prostředí.

Prezentace na téma: "Pokroky v moderních separačních metodách Hana Adamusová Metody pro analýzy estrogenů z životního prostředí."— Transkript prezentace:

1 Pokroky v moderních separačních metodách Hana Adamusová Metody pro analýzy estrogenů z životního prostředí

2 Co jsou endokrinní disruptory? polutanty v životním prostředí EDC (endocrine disrupting chemicals) látky s nepříznivými účinky na živé organismy projevují se změnami ve funkci endokrinních orgánů mohou simulovat chování přirozených hormonů vazbou na jejich receptory mohou blokovat vazbu endogenních hormonů na receptory nebo bránit syntéze specifických hormonů patří mezi ně např.: pesticidy, ftaláty, dioxiny, PAH, PCB, estrogeny a další estrogenní polutanty: 17 α -estradiol, 17 β -estradiol (BE2), estriol (E3), estron (E1) a mestranol a 17 α -ethynylestradiol (EE2) výskyt v nízkých koncentracích (desetiny až stovky ng/L) vysoce citlivé metody, kombinované s předseparačními a prekoncentračními technikami

3 Mechanismus působení EDC Převzato z A

4 Účinky EDC nepříznivý vliv na růst, reprodukci, imunitní a nervový systém zvířat i lidí poruchy pozorovány u šneků, ryb, rybožravých ptáků, aligátorů a mořských savců – především snižování plodnosti zvířata žijící v okolí čistíren odpadních vod → feminizace samců doba expozice (dětství x dospělost) různé druhy nádorových onemocnění – prsu,prostaty aj. předčasná puberta poruchy učení

5 Vstup do životního prostředí jako důsledek zvýšené produkce a konzumace řady léčiv a podpůrných látek úzce souvisí se zvyšujícím se užíváním antikoncepčních tablet převzato z B

6 převzato z A

7 Trend počtu uživatelek hormonální antikoncepce v letech 1970 – 2010 na 1000 žen ve věku 15 – 49 let Z dat Ústavu zdravotnických informací a statistiky ČR – Potraty 2010

8 Estrogeny steroidy vznik biotransformací cholesterolu pohlavní hormony vývoj primárních a sekundárních pohlavních znaků. 17 α -ethynylestradiol a 17 β -estradiol nejvíce v odpadních i povrchových vodách koncentrace 1 ng/L BE2 nebo 0,1 ng/L EE2 vyvolává u některých druhů ryb feminizaci samců. vylučovány jako konjugáty (sulfáty nebo glukuronáty). konjugované formy nevykazují biologickou aktivitu 17β-estradiol17α-ethynylestradiol

9 Stanovení estrogenů nejpoužívanější metody: ◦ chromatografické (HPLC, GC) ◦ imunochemické u chromatografií různé způsoby detekce nejčastěji využíván hmotnostní detektor (MS) často předřazen prekoncentrační krok nejčastěji extrakce tuhou fází (SPE)

10 Předúprava vzorku výskyt estrogenů v životním prostředí ve velmi nízkých koncentracích,i přesto toxické metody často nedostatečně citlivé nutná prekoncentrace volba postupu závisí na matrici, druhu analytu a jeho koncentraci steroidy převážně v kapalné fázi – LLE, SPE klasická extrakce (LLE) ◦ časově náročná ◦ velké objemy organických rozpouštědel extrakce tuhou fází (SPE) ◦ jednodušší experimentální realizace ◦ menší spotřeba organických rozpouštědel ◦ variabilita sorbentů

11 Předúprava vzorku převzato z C provedení online x offline nejčastěji používaný sorbent C18 pro RP mód: C8, C4, fenyl pro NP mód: diol, amino,kyano

12 Imunochemické metody založeny na reakci antigenu s protilátkou pro stanovení estrogenů - metoda enzymově vázané imunochemické analýzy (ELISA) v tzv. „sandwichovém“ uspořádání detekovanou složkou je zde antigen reakce může být značně specifická ◦ typ použité protilátky, monoklonální x polyklonální protilátka nenahraditelné při screeningu vzorků ze životního prostředí ◦ rychlost ◦ nízká cena ◦ možnost analyzovat vzorky přímo v terénu

13 Imunochemické metody vyvinuto několik metod ELISA pro stanovení estrogenů polyklonální protilátka spolu s SPE → vysoce selektivní a citlivé metoda, ◦ LOD pro estron určen jako 1,25 ng/L ◦ V rychlém screeningu pro stanovení BE2, E1 a EE2 v různých vodných matricích zahrnujících odpadní, říční i podzemní vody, ◦ porovnány 4 rozdílné komerčně dostupné monoklonální sady ELISA ◦ Vlastnímu stanovení předcházela úprava vzorků metodou SPE. ◦ Dynamický rozsah stanovení se pohyboval v rozmezí 0,05 – 5 µg/L a bylo dosaženo LOD 0,05 µg/L jejich citlivost je v řadě případů nedostačující pro stopové analýzy a analýzy strukturně podobných estrogenů kvůli nespecifické vazbě na protilátku při porovnání metod ELISA, GC a HPLC v tandemovém uspořádání s MS detekcí jsou výsledky všech těchto metod srovnatelné oproti GC má ELISA nižší citlivost vůči vlivům matrice

14 Plynová chromatografie vysoká separační účinnost, rychlost analýzy a možnost použití vysoce citlivých detektorů nutná derivatizace analytů provádí se po vysušení eluátu z SPE nejběžnější derivatizační technika silylace ◦ činidla např. N-methyl-N-trimethylsilyltriflouroacetamid, N-O-bis-(trimethylsilyl)triflouroacetamid ◦ vzniklé deriváty (trimethylsilyl a terc-butyldimethylsilyl) jsou charakterizované sníženou polaritou, zvýšenou těkavostí a lepší teplotní a katalytickou stabilitou ◦ doplněk k silylaci - alkylace

15 GC derivatizace anhydridem pentafluoropropionové kyseliny ◦ GC-MS analýza na koloně HP-5 MS (30 m × 0.25 mm s tloušťkou filmu 0,25 μ m) ◦ v módu sledování vybraného iontu (SIM) ◦ LOD = 0,6 – 2,5 ng/L pro estron,17 α - estradiol, 17 β -estradiol, estriol a mestranol, převzato z D Chromatogram EDC (a) standard ; (b) sediment spikovaný 10 ng/g směsí standardu (finální objem 0.1.mL); (c) reálný vzorek sedimentu z ústí řeky Pearl. legenda:(1) NP, (2) BPA-d16 (S.S), (3) BPA, (4) terphenyl-d14 (I.S), (5) α -E2, (6) E2, (7) E3, (8) E1, (9) MeEE2, (10) E2AC (S.S). estrogeny z odpadních vod ◦ optimalizována mikroextrakce tuhou fází následovaná metodou GC s tandemovou hmotnostní detekcí (MS/MS) ◦ LOD= 0,2 – 0,3 ng/L velmi citlivé stanovení BE2 a EE2 ve znečištěných vodách poskytovala metoda GC-MS/MS, LOD pro odpadní vodu činily 0,1 ng/L a pro povrchovou vodu 0,05 ng/L

16 Kapalinová chromatografie lze analyzovat estrogeny přímo, bez předchozí derivatizace. mobilní fáze: směsi vody (pufru) s organickým modifikátorem, nejčastěji methanolem nebo acetonitrilem. stacionární fáze jsou především chemicky vázané n-alkyly na silikagelovém nosiči, nejčastěji C18 nebo C8. nejčastěji se využívá reverzní separační mód samotné analýze často předchází prekoncentrace s využitím SPE nebo mikroextrakce tuhou fází (SPME). pro dosažení dostatečné citlivosti detekce je nejčastěji volena MS detekce v tandemovém uspořádání zlepšují se jak hodnoty LOD, tak LOQ.

17 Kapalinová chromatografie SPME-LC-ESI-MS s isokratickou elucí ◦ byla použita pro stanovení čtyř nejběžněji sledovaných estrogenů ve vodných vzorcích ◦ C8 kolona ◦ mobilní fáze o složení 0,01% roztok amoniaku ve směsi s acetonitrilem v poměru 60/40 (v/v) ◦ limity detekce se pohybovaly v rozmezí 2,7 – 11,7 ng/L LC-ESI-MS/MS ◦ kolona C18 ◦ binární mobilní fáze tvořená vodou a acetonitrilem s přídavkem amonné soli ◦ aplikován lineární gradient ◦ LOD 0,1 – 10 µg/L SPME-HPLC ◦ s UV detekcí při 280 nm (LOD 0,3 – 1,1 µg/L) ◦ s elektrochemickou detekcí (LOD 0,06 – 0,08 µg/L) ◦ C18 stacionární fáze ◦ mobilní fáze obsahující acetonitril a vodu s přídavkem 1% octové kyseliny a 0,5 g/L KCl. (obsah ACN byl během analýzy regulován gradientem)

18 LC SPE-LC-ESI-MS/MS s gradientovou elucí C18e stacionární fáze ACN jako organický modifikátor LOQ = 0,02 – 1,02 ng/L lineární odezva, selektivní a vyžadovala minimální přípravu vzorku převzato z E

19 Zdroje a použitá literatura A:http://web.bryant.edu/~dlm1/sc372/readings/toxicology/toxicology.htmhttp://web.bryant.edu/~dlm1/sc372/readings/toxicology/toxicology.htm B: http://www.potomac.org/site/SONR-2009/index.phphttp://www.potomac.org/site/SONR-2009/index.php C:http://services.leatherheadfood.com/mycotoxins/item.asp?sectionid=3&mytype=training& number=2&fsid=61http://services.leatherheadfood.com/mycotoxins/item.asp?sectionid=3&mytype=training& number=2&fsid=61 D: Peng X., Wang Y., Yang C., Chen F., Mai B.: Journal of Chromatography A, 1116 (2006), 51-56 E: Díaz-Cruz M. S., López de Alda M. J., López R., Barcelo D.: Journal of Mass Spectrometry 38 (2003), 917-923. López de Alda M. J., Barceló D.: Journal of Chromatography A 892 (2000), 391-406. Wagner M., Oehlmann J.: Environmental Science and Pollution Research 16 (2009), 278-286. Zuehlke S., Duennbier U., Heberer T.: Journal of Separation Science 28 (2005), 52-58. Suzuki Y., Matuyama T.: Water Research 40 (2006), 1061-1069. Farre M., Kuster M., Brix R., Rubio F., Lopez de Alda M., Barcelo D.: Journal of Chromatography A 1160 (2007), 166-175. Pacáková V.; Loukotková L.; Bosáková Z.; Štulík K.: Journal of Separation Science 32 (2009), 867-882.

20 Použitá literatura Peng X., Wang Y., Yang C., Chen F., Mai B.: Journal of Chromatography A, 1116 (2006), 51-56. Carpinteiro J., Quintana J. B., Rodriguez I., Carro A. M., Lorenzo R. A., Cela R.: Journal of Chromatography A 1056 (2004), 179-185. Huang C. H., Sedlak D. L.: Environmental Toxicology and Chemistry 20 (2001), 133-139. Mitani, K.; Fujioka, M.; Kataoka, H.: Journal of Chromatography A 1081 (2005), 218-224. Hu J., Zhang H, Chang H.: Journal of Chromatography A, 1070 (2005), 221-224. Rodriguez-Mozaz S., López de Alda M. J., Barcelo D.: Analytical Chemistry 76 (2004), 6998- 7006. López de Alda M. J., Barcelo D.: Fresenius Journal of Analytical Chemistry 371 (2001), 437-447.

21 Děkuji za pozornost