IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Michael Jelínek, Jan Šrámek Lenka Rossmeislová

V praktiku budou řešeny dvě úlohy: 1) Detekce proteinů a DNA v rakovinných buňkách - fluorescenční barvení 2) Detekce proteinů po izolaci a následné separaci pomocí SDS-PAGE (Sodium DodecylSulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)

Úloha 1: Fluorescenční barvení mikrofilament a DNA aktin: faloidin konjugovaný s fluoroforem TRITC - červený signál DNA: DAPI - modrý signál použité buňky - buněčná linie MCF-7 (rakovinné buňky nádoru prsu) Použité cytostatikum - taxan paclitaxel

Fluorescenční barvení - princip fluorofor Signál produkující molekula → zviditelnění detekované molekuly interagující s detekovanou molekulou Molekula specificky Detekovaná molekula ve vzorku „neviditelné“

Fluorescenční barvení - detekce mikrofilament Faloidin jed z houby Amanita phalloides specificky se váže na mikrofilamenta (tzv. F-aktin) a zabraňuje jejich depolymerizaci (mechanismus toxicity) fluorofor TRITC vyzařuje červené světlo po excitaci zeleným světlem

METODA 1: Fluorescenční barvení – detekce mikrofilament TRITC → zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu phalloidin F-aktin ve vzorku „neviditelné“

Fluorescenční barvení - detekce DNA DAPI interkaluje se do malého žlábku dsDNA, tato vazba zvyšuje excitační vlastnosti DAPI po excitaci UV světlem vyzařuje modré světlo, volný DAPI svítí mnohem méně - není potřeba promývat

Fluorescenční barvení - detekce DNA DAPI UV DNA → zviditelnění detekované molekuly po excitaci fluoroforu DAPI DNA ve vzorku „neviditelné“

Fixace - první krok přípravy vzorku brání rozkladu a autolýze tkáně cíl  zachování biologického materiálu v průběhu přípravy vzorku co možno nejblíže jeho přirozenému stavu Formaldehyd (= formalín) vytváří kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni rozpustné proteiny se naváží na cytoskelet

Pracovní postup: fixace buněk roztokem formaldehydu v PBS (phosphate buffered saline) odstranění roztoku formaldehydu pomocí opakovaného promytí v roztoku PBS inkubace buněk s konjugátem faloidinu-TRITC odstranění nevázaného faloidinu-TRITC pomocí opakovaného promytí v PBS barvení DNA pomocí DAPI pozorování ve fluorescenčním mikroskopu

Fluorescenční barvení mikrofilament Kontraktilní prstenec

Fluorescenční barvení mikrofilament a DNA Jak se liší mikrofilamenta a jádra v rostoucích a nerostoucích buňkách?

Úloha 2: Detekce proteinů po izolaci a následné separaci pomocí SDS-PAGE - dnes I. část Vzorky: kuřecí sval, roztok BSA, mléko Izolace proteinů z tkáně: prvním krokem je dezintegrace tkáně a buněk Chemicky (používáme v našem experimentu) mechanicky ultrazvuk

Pracovní postup: Izolace proteinů Stanovení koncentrace proteinů přenos tkání a poteinů do zkumavky dezintegrace buněk a resuspendování proteinů pomocí lyzačního pufru obsahujícího SDS (sodium dodecylsulfát) oddělení směsi proteinů od nezlyzovaných zbytků centrifugací Stanovení koncentrace proteinů pomocí metody podle Bradfordové použití BSA (bovine serum albumine = hovězí sérový albumin) jako standardu pro vytvoření kalibrační křivky

Princip metody Bradfordové kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordové činidla s roztokem obsahujícím proteiny Bradfordové činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech (ARG, PHE, TRY a PRO) po navázání barviva na aminokyseliny dochází ke změně barvy roztoku z hnědé na modrou detekce při 595 nm

Kalibrační křivka

Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE Příště uvidíte... Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE povaření vzorků se vzorkovým pufrem obsahujícím SDS nanesení vzorků obsahujících požadované množství proteinů na polyakrylamidový gel separace proteinů pomocí elektroforézy Identifikace proteinů barvení gelu se separovanými proteiny v roztoku Coomassie Brilliant blue lokalizace proteinů v gelu, porovnání hladiny proteinů v jednotlivých vzorcích