Cukerná signalizace  změny v hladině signálního metabolitu Koordinace růstu Jaké procesy sacharidová signalizace ovlivňuje ?? klíčení a časný vývoj semenáčků, další vegetativní vývoj, reproduktivní vývoj, senescenci a reakce na změny prostředí a stres Na jaké úrovni ??? úrovni transkripce, stability RNA, translace, stability proteinů i posttranslační regulaci Koordinace růstu a vývoje rostliny s hladinou cukru vyžaduje mechanismus vnímání dostupnosti C  změny v hladině signálního metabolitu  vazba na senzor změny v dostupnosti C  spuštění signální dráhy  odezva Systémy účastnící se cukerné signalizace: hexózová signalizace ---- hexokináza ---- glukózová signalizace nezávislá na hexokináze ---- fruktózová signalizace sacharózová signalizace SnRK1 trehalóza-6-P invertáza ….

Cukerná signalizace Jaké procesy sacharidová signalizace ovlivňuje ?? Koordinace růstu Cukerná signalizace Jaké procesy sacharidová signalizace ovlivňuje ?? klíčení a časný vývoj semenáčků, další vegetativní vývoj, reproduktivní vývoj, senescenci a reakce na změny prostředí a stres Na jaké úrovni ??? úrovni transkripce, stability RNA, translace, stability proteinů i posttranslační regulaci Koordinace růstu a vývoje rostliny s hladinou cukru vyžaduje mechanismus vnímání dostupnosti C --- změny v hladině signálního metabolitu --- vazba na senzor změny v dostupnosti C --- spuštění signální dráhy --- odezva Systémy účastnící se cukerné signalizace: hexózová signalizace ---- hexokináza ---- glukózová signalizace nezávislá na hexokináze ---- fruktózová signalizace sacharózová signalizace SnRK1 trehalóza-6-P invertáza

Hexózové systémy signalizace Cukerná signalizace Hexózové systémy signalizace Glukózová signalizace - signalizační dráhy indukovatelné glukózou: AtHXK- hexokináza dráha vyžadující fosforylaci, ale nevyužívající hexokinázu jako senzor ??? dráha nevyžadující fosforylaci cukrů (senzor spřažený s G-proteinem ) Fruktózová signalizace - signalizační dráha indukovatelná fruktózou 1

Hexokináza (HXK) Signál bifunkční enzym fosforylace hexóz Cukerná signalizace -HXK Hexokináza (HXK) bifunkční enzym fosforylace hexóz cukerná signalizace Mutantní AtHXK1 (bodová mutace)  0 kinázová aktivita, zachovaný signalizační potenciál INV / HK X SuSy / FK Štěpení sacharózy: glukóza fruktóza HXK Invertázami HX-P Signál UDPG fruktóza SuSy (sacharózasyntázou) F- P FK Změna : štěpení invertázou štěpení SuSy, spojena s vývojovými změnami

Monitoruje tok kontrolním bodem metabolizmu Cukerná signalizace -HXK Hexokináza (HXK) – lokalizace v buňce Arabidopsis : 3 HXK geny, 3 HXK-like – pletivo-specifické exprese, stresově-specifické exprese Isoformy se liší biochemickými vlastnostmi: Afinitou k substrátu (přednostně glukóze) ADP inhibicí G-6-P inhibicí, různá úroveň u různých isoforem T-6-P inhibice nezjištěna ! HXK signalizace - esenciální pro represi fotosyntetických genů Monitoruje tok kontrolním bodem metabolizmu ???Význam existence isoforem s různými vlastnostmi a rozdílnou lokalizací ??? Claeyssen & Rivoal, 2007 Lokalizace v jádře ! aklimace fotosyntézy ! – interakce HXK-1 s AHA-B1, a RPT5B (podjednotky vakuolární ATPázy a proteasomového komplexu)

Monitoruje tok kontrolním bodem metabolizmu Cukerná signalizace -HXK Hexokináza (HXK) – lokalizace v buňce Arabidopsis : 6 HXK genů – pletivo-specifické exprese, stresově-specifické exprese Isoformy se liší biochemickými vlastnostmi: Afinitou k substrátu (přednostně glukóze) ADP inhibicí G-6-P inhibicí, různá úroveň u různých isoforem T-6-P inhibice nezjištěna ! Glukóza HXK signalizace - esenciální pro represi fotosyntetických genů HXK_1 Fotosyntetické geny PRPT5B Monitoruje tok kontrolním bodem metabolizmu m RNA AHA _B1 ???Význam existence isoforem s různými vlastnostmi a rozdílnou lokalizací ??? Claeyssen & Rivoal, 2007 Lokalizace v jádře ! aklimace fotosyntézy ! – interakce s AHA-B1, a RPT5B (podjednotky vakuolární ATPázy a proteasomového komplexu)

Monitoruje tok kontrolním bodem metabolizmu Cukerná signalizace -HXK Hexokináza (HXK) – lokalizace v buňce Arabidopsis : 6 HXK genů – pletivo-specifické exprese, stresově-specifické exprese Isoformy se liší biochemickými vlastnostmi: Afinitou k substrátu (přednostně glukóze) ADP inhibicí G-6-P inhibicí, různá úroveň u různých isoforem T-6-P inhibice nezjištěna ! Glukóza HXK signalizace - esenciální pro represi fotosyntetických genů HXK m RNA PRPT5B Monitoruje tok kontrolním bodem metabolizmu AHA -B1 ???Význam existence isoforem s různými vlastnostmi a rozdílnou lokalizací ??? Claeyssen & Rivoal, 2007 Lokalizace v jádře ! aklimace fotosyntézy ! – interakce s AHA-B1, a RPT5B (podjednotky vakuolární ATPázy a proteasomového komplexu)

etylén ABA auxin cytokinin Cukerná signalizace Interakce HXK signalizace se signalizačními drahami fytohormonů Glukóza etylén HXK HXK1- independentní ABA1 ABA2 ABA3 AA03 ABI3 ABI4 ABI5 ABF2 ABF3 ABF4 EIN2 ABA EIN3 auxin cytokinin Stresová reakce Klíčení / časný vývoj semenáčků Podle Rolland et al., 2006

Fruktózová signalizace cytosol Trióza-P Pi Fruktóza 1,6 bis-P Sacharóza 6-P Sacharóza Glukóza 1-P UDP-Glukóza Fruktóza 6-P Glukóza 6-P FFK- fosfofruktokináza FBF- fruktózabisfosfátfosfatáza FFF- PPi- dependentní fosfofruktokináza Fruktózová signalizace Fruktózová signalizace nezávislá na HXK1 Interakce s ABA a etylénovou signalizací (Li et al., 2011) Regulační funkce nezávislá na katalytická funkci Cho et al., 2011 Fruktóza Glukóza HXK1 FBF ABA2 ABI3,4,5 ERF1 ABA2 - syntéza ABA ABI - ABA signalizace ERF1 - signalizace etylenu (ethylene response factor)

Sacharózová signalizace Sacharóza reguluje procesy, které nejsou ovlivňovány hexózovými signalizacemi Vnímání se děje na plazmatické membráně ? pomocí transportérů ?? Jiným mechanismem ??? Wind et al., 2010 Co je specifickým senzorem sacharózy ??? Regulace translace

Regulace translace sacharózou Regulace exprese bZIP TF dostupností sacharidů (prokázáno u 10 bZIP TF) Exprese bZIP11 indukovatelná sacharidy včetně sacharózy Hummel et al., 2009

Inhibice růstu, modulace metabolizmu sacharidů, aminokyselin, Exprese bZIP11 indukovatelná sacharidy včetně sacharózy Regulace translace sacharózou Sacharóza SC bZIP11 AKIN10/11 bZIP11 T-6-P Aktivace genů Inhibice růstu, modulace metabolizmu sacharidů, aminokyselin,  translokace C Hummel et al., 2009

Sacharóza Regulace translace sacharózou Exprese bZIP11 indukovatelná sacharidy včetně sacharózy Regulace translace sacharózou Sacharóza Sacharóza SC bZIP11 SC bZIP11 AKIN10/11 AKIN10/11 bZIP11 bZIP11 overexprese bZIP11  inhibice růstu připomínající reakci na nízký obsah cukrů Ma et al., 2011 Aktivace genů Inhibice růstu, modulace metabolizmu sacharidů, aminokyselin,  translokace C T-6-P Další bZIP TF reprimovatelné sacharidy X represe i na úrovni transkripce, neznámý mechanismus, jen u bZIP1 účast hexokinázy Matioli et al., 2011 Aktivace genů Růst, modulace metabolizmu sacharidů, aminokyselin  translokace C Hummel et al., 2009

 SnRK 1 (SNF-related protein kinase ) Senzor nízké hladiny cukrů Cukerná signalizace –SnRK1 SnRK 1 (SNF-related protein kinase ) Homolog kvasinkového SNF1 – zodpovědného za aktivaci metabolické odpovědi při nepřítomnosti glukózy Transkripční regulace : SuSy, -amyláza, ADPGáza, SPS, a aktivace celé řady dalších genů účastnících se degradace buněčných stěn, aminokyselin, proteinů a lipidů. Řízení řady genů kódujících transkripční faktory a faktory remodelace chromatinu Posttranskripční regulace : HMG-CoA reduktáza, SPS, NR, T-6-P syntáza, ADPGáza, heat shock proteiny SnRK3 SnRK2 SNF1 SnRK1 AMPK- živočišná Rostliny obsahují SnRK2 a SnRK3 genové subrodiny – málo prostudované, pravděp. aktivní při osmotickém stresu Arabidopsis –heterotrimer, subjednotky : - katalytická, , -regulační - pravděpodobně stejná struktura u jiných rostlin    Overexprese AKIN 10 u Arabidopsis  oddálení senescence při stresu nedostatku C, oddálené kvetení, změna architektury květenství Aktivita SnRK1 je inhibována cukry; G-6-P  Senzor nízké hladiny cukrů

Regulace metabolizmu cukry G-6-P tma Vývoj Stresová reakce SnRK1 Cukerná signalizace –SnRK1 Regulace metabolizmu T-6-P syntáza HMC-CoA reduktáza NR SPS posttranslační regulace SuSy amyláza geny degradace stěn, AK, proteinů, lipidů cukry G-6-P SnRK1 transkripční regulace Abiotický stres Stres napadení patogenem, herbivorem tma Fertilita Organogeneze Senescence Vývoj Stresová reakce Podle Polge & Thomase, 2006 Vnímání dostupnosti C a energie - aktivace katabolismu, potlačení anabolismu

Trehalóza UDPG + G-6-P  T-6-P  trehalóza  glukóza Cukerná signalizace T-6-P Trehalóza Původní představa: většina rostlin ne, role převzala sacharóza Současná představa: Všechny rostliny obsahují trehalózu hladiny  µg/g f.w. tedy ne osmoprotektant UDPG + G-6-P  T-6-P  trehalóza  glukóza TP-syntáza TP-fosfatáza trehaláza trehalóza Arabidopsis thaliana TPS 11 genů (2 skupiny) TPP 10 genů (2 skupiny) Trehaláza 1 gen) SPS 4 geny (3 skupiny) SPP 4 geny Invertáza 17 genů (4 skupiny) SuSy 6 genů Paul et al., 2008

Trehalóza UDPG + G-6-P  T-6-P  trehalóza  glukóza Cukerná signalizace T-6-P Trehalóza Původní představa: většina rostlin ne, role převzala sacharóza Současná představa: Všechny rostliny obsahují trehalózu hladiny  µg/g f.w. tedy ne osmoprotektant UDPG + G-6-P  T-6-P  trehalóza  glukóza TP-syntáza TP-fosfatáza trehaláza trehalóza Arabidopsis thaliana TPS 11 genů (2 skupiny) TPP 10 genů (2 skupiny) Trehaláza 1 gen) SPS 4 geny (3 skupiny) SPP 4 geny Invertáza 17 genů (4 skupiny) SuSy 6 genů Paul et al., 2008

 syntézy trehalózy  neschopnost zrání embryí Cukerná signalizace T-6-P AtTPS1 exprese v Arabidopsis vykazují Glc a ABA insenzitivní fenotyp během klíčení Interakce s hexokinázovou signalizací, se syntézou ABA a signalizační dráhou ABA Avonce et al., 2004 Arabidopsis, růst na médiu s trehalózou  škrob,  ATP, inhibice růstu kořenů Vliv na syntézu škrobu : ADPGázy i degradaci :  glukan-voda-dikináza,  -amyláza, ale !!! jen ve zdrojových listech a ne v kořenech Ramon et al., 2007 Tabák zvýšená aktivita TPS ---zvýšená fotosyntetická kapacita na jednotku listové plochy; Pellny et al., 2004 Př. WT TPS linie Rýže Garg et al., 2002  syntézy trehalózy  odolnost k nedostatku vody Hanson et al., 2006  syntézy trehalózy  neschopnost zrání embryí syntézy TPP  změny stavby květenství Satoh-Nagasawa et al., 2006 Wingler et al., 2012   hladiny T-6-P  změny v nástupu senescence

Ostatní ?? Jiná funkce ? Regulační subjednotky TPS1 ?? Jenže ! Pouze TPS 1 – prokazatelná aktivita (skupina I) TPS 1- konstitutivní exprese, N- koncové rozšíření je autoinhibiční TPS skupiny II regulovány světlem, cukry, hladověním, denním rytmem, cytokininy.. , Fosforylace SnRK1 a Ca2+ dependentními kinázami, TPS 5-7 po fosforylaci vazba s 14-3-3 (DNA x protein analýzy TPSs skupiny II  synonymní substituce ) Různé TSP geny jsou indukovány různými signály: např. : TPS5 .. indukce sacharózou TPS8.. indukce tmou, cytokininem TPS11.. represe hypoxií TPS1 … indukce ABA ve svěracích buňkách ….totéž pro TPP např. : TPP3, TPP9,TPP10.. indukce hypoxií TPP 3.. nitrátem TPP ( tři geny) .. ABA ………………

Differential expression profiles of Arabidopsis TPP genes. Vandesteene et al., 2012

+ G-6-P T-6-P SnRK1 trehalóza UDPG ADPGPáza škrob Glukóza, sacharóza, nitrát, ABA, cytokinin, vývoj ovlivňují expresi a post-translační regulaci enzymů syntézy trehalózy Tvorba komplexu AtTPS s CDKA;1 ? Interakce s buněčným cyklem ?? Geelen et al., 2007 SnRK1 sacharóza G-6-P + T-6-P syntáza T-6-P T-6-P fosfatáza trehalóza UDPG AKIN 11 exprese, ale ne !! v dospělých listech, faktor I ABI4 exprese Fotosyntéza Stresová reakce Vývoj embryí ADPGPáza Architektura květenství Buněčné dělení škrob ??? Účastní se trehalóza regulace získávání C symbiotickou houbou ? Lopez et al., 2007 Utilizace C chloroplast Podle Paul, 2007

Sacharidová signalizace Stěnová invertáza generující signál o hladině sacharózy v apoplastu ???? Sacharidová signalizace Mnohočetný systém vnímání vytvářející signalizační síť Myo–inositol Cukerné alkoholy Sacharidy rafinózové řady Komplexní síť interagující s ostatními signálními systémy Nemá hierarchickou stavbu, každá složka systému monitoruje jinou úroveň metabolizmu Signály jsou integrovány, a teprve poté je ovlivněn konkrétní růstový nebo vývojový proces Nepřímá účast invertáz a transportérů na cukerné signalizaci kontrolou cytosolické koncentrace cukerných signálních molekul (sacharózy, glukóza, G-6-P, fruktóza….)

Regulace dostupnosti N jako odpověď na změny vnějších a vnitřních podmínek upravují transportní aktivity NO3- dle dostupnosti skladují NO3- ve vakuole upravují architektutu kořene dostupnosti NO3- upravují asimilaci NO3- podle požadavku rostliny Krouk et al., 2010 Koordinace asimilace N a dostupnosti C a energie Signální síť zahrnující NO3-, NH4+, glutamát, glutamin, aspartát, NADH.. ……… a signály z C metabolizmu

C/N rovnováha SnRK1 NR regulace exprese nia genů – nitrát,  cukry,  Gln, světlo/tma post-translační modifikace – inhibice fosforylací a vazbou 14-3-3 proteinu fosforylace/ defosforylace závislá na G-6-P hladině (SnRK1), světle Kapacita asimilace N reaguje na dostupnost C pomocí integrovaných signálů fytohormonů, nitrátů, cukrů, org. kyselin a AK SnRK1 P SPS SPS Sacharóza Hexóza-P chloroplast OAA PEP Trióza-P P PEPC PEPC NO2- NH4+ NO3- NO2- NR AK GS/GOGAT P NR mitochondrie OAA citrát 2-OG 2-OG Nitrate levels in the soil solution can vary by three to four orders of magnitude. Transporter genes that encode representatives of each class of transport system have been identified and fall into two families: NRT1 and NRT2. Members of these families are induced in response to nitrate in the environment and are regulated by internal signals including nitrogen metabolites and shoot demand for nitrogen. The evidence to date indicates that the NRT2 transporters contribute specifically to the nitrate-inducible, high affinity nitrate uptake system while the NRT1 transporters contribute more broadly to nitrogen uptake and show both inducible and constitutive expression. Of the macronutrients required by plants, nitrogen is consumed in the greatest abundance and most often limits growth. Most plant species are able to absorb and assimilate nitrate (NO3, ammonium (NH4) urea and amino acids as nitrogen sources, but the response to a particular form of nitrogen varies from species to species. In general, most crop plants prefer a mixture of ammonium and nitrate and will take up a higher proportion of ammonium to nitrate than is present in the soil solution. In a typical aerobic agricultural soil, both nitrate and ammonium are present, but nitrate is the major form PEPC regulace aktivace světlem a NO3- Modulace světlem – fosforylací/defosforylací -- katalyzováno PEPC protein kinázou  změna citlivosti k efektorům ( citlivost k inhibici malátem) Transkripce PEPC protein kinázy řízena metabolickými signály: NO3- a metabolity C a N metabolismu

 obsahu cytokininů  dělení buněk  dělení buněk  síly sinku C/N Porušení rovnováhy v získávání C a N  změna alokace ve prospěch nadz. části resp. kořenů Rozdělování asimilátů při N deficienci: Posílení růstu kořenů Omezení růstu nadzemní části   Alokace C do kořenů protože: -N   produkce cytokininů   transportu cytokininů  obsahu cytokininů list kořen    dělení buněk  dělení buněk  síly sinku  síly sinku  konc. C ve floému  konc. C ve floému gradient C  směrování toku do kořenů X

Velké nároky na koordinaci procesů v rostlině Harmonizace růstu a vývoje jednotlivých částí rostliny Udržení stability vnitřního prostředí Výměna látek mezi částmi rostliny Reakce rostliny na změny vnějšího prostředí Transport a distribuce asimilátů v rostlinách a sacharidová signalizace – podstatná role Pravděpodobně mnohem složitější: rostliny s významným podílem metabolizmu manitolu, sorbitolu…, volemitolu…, RFO a oligosacharidů s cyklitoly jako základními komponentami ……

Díky za pozornost..