Metody používané v biochemii (centrifugace, elektroforéza, dialýza) Krev Metody používané v biochemii (centrifugace, elektroforéza, dialýza) Pavla Balínová

KREV Krev tvoří asi 8% hmotnosti lidského těla. Složení krve: buňky (erytrocyty, leukocyty) buněčné fragmenty (trombocyty) krevní plazma Krevní buňky a buněčné fragmenty zabírají asi 45% celkového objemu krve. Hematokrit je podíl objemu krve, který je zaujímán erytrocyty. Normální hematokrit u muže je asi 45 % a u ženy asi 42 %.

Funkce krve: Transport 2. Homeostáza 3. Obrana 4. Krevní srážení

Krevní plazma Krevní plazma je vodný roztok obsahující: elektrolyty: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, HCO3-, HPO4- živiny metabolity: Glc, laktát, Pyr, urea, kreatinin, amoniak, TAG, cholesterol proteiny: albuminy a globuliny vitaminy stopové prvky hormony: inzulín, glukagon, kortikoidy atd. Voda tvoří 90% celkového objemu krevní plazmy. Celkový objem vody v plazmě u dospělého jedince se pohybuje okolo 2,5 – 3,0 litru.

Fyziologické hodnoty některých parametrů krve (velmi důležité pro praxi!!!) osmolarita 290 – 300 mosmol/l pH = 7,35 – 7,45 Na+ = 135 – 145 mmol/l K+ = 3,5 – 5,5 mmol/l Ca 2+ = 2,05 – 2,65 mmol/l Cl- = 100 – 110 mmol/l HCO3- = 22 – 26 mmol/l

Plazmatické proteiny jejich koncentrace je 60 – 80 g/l (tzv. celková bílkovina) je známo asi 100 různých proteinů v plazmě proteiny jsou rozděleny do 5 tříd dle jejich chování během elektroforézy: Albuminy α1-globuliny α2-globuliny β-globuliny γ-globuliny Všechny globuliny jsou rozpustné ve vodě v přítomnosti solí a náleží mezi glykoproteiny.

Albumin Albumin je rozpustný ve vodě a je syntetizován v játrech. – koncentrace v krvi asi 45 g/l (35 – 50 g/l) - poločas albuminu v plazmě asi 20 dní Funkce: transport: FA, bilirubin, některé steroidní hormony, vitaminy, léčiva udržování onkotického tlaku krve pufrační schopnosti

α1-globuliny Příklady α1-globulinů: antitrypsin a antichymotrypsin protrombin = koagulační faktor II transkortin – transport kortizolu kyselý glykoprotein – transport progesteronu TBG (thyroxin-binding globulin) – transport thyroxinu T4 a trijódtyroninu T3

α2-globuliny ceruloplasmin – transport Cu iontů haptoglobin – vazba volného hemoglobinu makroglobulin – vazba proteáz, transport Zn2+ iontů retinol-binding protein – transport vitamínu A vitamin D-binding protein - transport kalciolů

β-globuliny LDL – transport esterů cholesterolu a TAG transferrin – transport Fe iontů fibrinogen = koagulační faktor I sex hormone-binding globulin – transport testosteronu a estradiolu transkobalamin – transport vitamínu B12 C-reaktivní protein – aktivace komplementu

γ-globuliny Ig A – mukózu-chránící protilátky Ig D – receptor B-lymfocytů Ig E - reagens Ig G – pozdní protilátky Ig M – časné protilátky

Odběr kapilární krve z prstu pacientova ruka musí být čistá, suchá a teplá vpich by měl být proveden na boční straně bříška prstu krev je poté sbírána pomocí skleněné kapiláry do odběrového systému  

Plazma x sérum Plazma je získávána z venózní, arteriální nebo kapilární celé krve. Antikoagulační činidlo je používáno k zabránění krevního srážení (např. citrát Na, heparin, oxalát K, K2EDTA nebo Na2EDTA). Vzorek krve je centrifugován a plazma se oddělí od krvinek. Sérum je získáváno z celé krve. Celá krev se nechá srážet 20 min až 2 hod a poté je vzorek krve centrifugován. Sérum je žlutá kapalina, která neobsahuje srážecí faktory. !!! Sérum je krevní plazma bez přítomnosti fibrinogenu a dalších srážecích faktorů !!!

Sérum Sérum Koagulum

METODY POUŽÍVANÉ V BIOCHEMII Centrifugace je metoda používaná k separaci částic z roztoku podle jejich velikosti, hustoty, tvaru, viskozity média a rychlosti rotoru. Buňky, organely, viry, velké molekuly (proteiny, nukleové kyseliny) mohou být separovány centrifugací. Odstředivá síla určuje rychlost sedimentace částic při centrifugaci.

Rotor je nejdůležitější částí centrifugy. Rychlost centrifugace je vyjádřena jako RPM nebo RCF: RPM = revolutions per minute (př. 10 000 RPM) RCF = relative centrifugal force, jednotka: násobky g (g = 9,81 m/s2) - udává kolikrát je RCF větší než gravitační zrychlení g !!! Kyvety (zkumavky) se musí vyvážit před centrifugací a poté vložit do rotoru vždy proti sobě!!!

Klasifikace centrifugačních metod: analytická centrifugace se používá k měření fyzikálních vlastností sedimentujících částic (sedimentační koeficient, molekulová hmotnost) preparativní centrifugace se používá k separaci částic lišících se velikostí a hustotou. Po centrifugaci jsou získány 2 frakce: pevná frakce = pelet, tekutá frakce = supernatant

B) Elektroforéza (elfo) je analytická metoda určená pro separaci elektricky nabitých molekul (např. proteinů) Elektroforetická pohyblivost molekuly závisí na náboji, velikosti a tvaru molekuly a vloženého napětí. Gelová elfo – pevné médium tvoří gel (agarózový, acetátcelulózový, polyakrylamidový) Elfo lze použít k separaci proteinů, izoenzymů, nukleových kyselin a imunoglobulinů.

Elektroforéza proteinů krevního séra A = normální sérum B = akutní zánětlivá odpověď C = paraproteinémie D = normální plazma s proužkem fibrinogenu Obrázek byl převzat z http://www.rlbuht.nhs.uk

Vyhodnocení elektroforézy Graf získaný z denzitometrie ● Kvalitativní detekce gelu pomocí standardů ● Kvantitativní detekce gelu pomocí denzitometru (skenování intenzity zbarvení jednotlivých frakcí pomocí denzitometru) Obrázek byl převzat z http://www.aafg.org

C) Dialýza je frakční difúze nízkomolekulárních látek přes semipermeabilní membránu z roztoku o vyšší koncentraci do roztoku o nižší koncentraci Hemodialýza je používána k odstranění odpadních produktů metabolismu (např. urea, kreatinin, kyselina močová) z pacientovy krve do izotonického roztoku Obrázek byl převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Hemodialysis

Schéma hemodialyzačního přístroje Obrázek byl převzat z http://kidney.niddk.nih.gov/kudiseases/pubs/hemodialysis/ images/dialysis.gif

Jak vypadá hemodialýza uvnitř? Obrázek byl převzat ze stránky Hemodialysis z National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases