5.r. seminář RNDr Z.Polívková Cytogenetika nádorů 5.r. seminář RNDr Z.Polívková

Nádory = heterogenní skupina chorob, jejichž iniciace a progrese je podporována změněnou funkcí genů, které pozitivně nebo negativně regulují buněčnou proliferaci, ovlivňují apoptózu, DNA reparaci, stabilitu genomu, adhezi buněk, angiogenezi, invazivitu a schopnost metastazovat tzv. „nádorových genů“

Nádor je způsoben postupnou akumulací četných genetických a epigenetických změn Hnací silou karcinogeneze - genomová nestabilita = zvýšená tendence k alteracím v genomu

Přehled mechanismů, které udržují stabilitu genomu během buněčného cyklu Deregulace genů, které zajišťují tyto funkce vede ke genomové nestabilitě Upraveno dle Shen 2011

Interindividuální variabilita v expresi nádorů dána: rozdíly v množství vzniklého DNA poškození schopností toto DNA poškození opravovat Obojí je ovlivněno genetickou predispozicí a zevními faktory, včetně životního stylu Individuální odpověď na exogenní a endogenní genotoxiny je modifikována polymorfismy genů: kodujících enzymy metabolismu xenobiotik kodujících enzymy DNA reparace nebo enzymy folátového metabolismu = tzv. nízko penetrantní geny

Změněné funkce cca 350 genů jsou spojeny s nádory tzv„ nádorové geny“ (vysoce penetrantní): protoonkogeny nádorové supresorové geny Geny DNA reparace - mutatorové geny – nepřímý efekt přímý efekt

Změny funkce genů ovlivněny: genovými polymorfismy změnami počtu kopií (amplifikace, delece, duplikace, změny počtu chromozomů) změnami struktury genů, chromozomů (translokace, inverze aj.) bodovými mutacemi (substituce, delece, inzerce v kodující sekvenci nebo na rozhraní exonů a intronů) epigenetickými modifikacemi (imprinting, metylace DNA a modifikace histonů-acetylace/deacetylace histonů,metylace n. fosforylace histonů)

Aktivace onkogenů (změna protoonkogenu na onkogen): mutace strukturní přestavba (reciproké translokace, inverze) amplifikace (DM, HSR) epigenetické změny inzerce/transdukce viru Inaktivace tumor supresorových genů: delece epigenetické modifikace mitotická rekombinace

v Iniciačně promoční teorie vzniku nádorů Nádor Prokarcinogen Metabolic.aktivace enzymy I.fáze Ultimativní karcinogen Detoxikace enzymy II.fáze Iniciace 1-2 dny Promoce 10 let Progrese  1 rok v Normální buňka Iniciovaná buňka Preneoplastické buňky Nádor

CHA a nádory 1. Specifická CHA u nádorů - přestavby v blízkosti protoonkogenů – abnormální aktivita produktu, - abnormální exprese genu přestavba pouze v nádorových buňkách (př. chronická myeloidní leukemie, Burkittův lymfom) - delece nádorových supresorových genů v nádorových buňkách nebo jako konstituční aberace (heterozygot) (př. retinoblastom) 2. Dědičné syndromy se zvýšenou lomivostí chromozomů defekt reparace nebo replikace  riziko malignit

Význam studia chromozomů u nádorových onemocnění: diagnóza a subklasifikace hematologických malignit racionální výběr terapie (cílená terapie) prognostické informace monitorování léčebného efektu, sledování reziduál.leukemie… studie mechanismu karcinogeneze CHA u nádorů: CHA beze ztráty materiálu: translokace, inverze CHA se ztrátou materiálu: delece, monozomie CHA se ziskem materiálu: duplikace, trizomie, polyploidie, amplifikace Primární změny souvisí s iniciací maligního procesu Sekundární změny – souvisí s progresí choroby, s genomovou nestabilitou

Primární změny související s iniciací choroby Translokace – 2 typy Translokace při kterých vznikají fuzované geny (geny s funkcí v regulaci buněčného dělení a diferenciaci - protoonkogeny) př. CML = chronická myeloidní leukemie Ph1 chromozom = t (9;22)(q34;q11) protoonkogen c-abl z 9q přenesen na 22q - chimerický (fuzovaný) gen bcr/abl → abnormální protein P210 se stálou tyrozinkinázovou aktivitou - abnormální stimulace buněčného dělení (zlomy v intronech genů – translokace odstraní doménu, která normálně inhibuje kinázu a nahradí ji fragmentem bcr, který ji aktivuje)

během blastické krize další změny (další Ph1 , +8, i(17q), +19) Ph1 u CML znamená dobrou prognózu během blastické krize další změny (další Ph1 , +8, i(17q), +19) Ph1 u ALL (akutní lymfoblastická leukemie) - jiná místa zlomu v oblasti bcr – chimerický protein P190 Ph1 u ALL = špatná prognóza, špatná odpověď na terapii

Cme.medscape.com

Fuzovaný gen brc/abl Wysis katalog 1996/97

Jiné příklady fuzovaných genů: ALL t(1;19) dobrá prognóza der(19)t(1;19) špatná prognóza t(12;21) dobrá prognóza akutní promyelocyt.leu (M3) t(15;17) dobrá prognóza akutní myelocytic leu (M2) t(8;21) dobrá prognóza ALL a AML t(4;11) špatná prognóza Ewingův sarkom t(11;22), t(21;22) Melanom t(11;22) Dosud popsáno cca 600 různých genových fuzí 30% nádorů spojeno s fuzními geny (Mitelman, 2010)

Fuzní geny popsány i u epiteliálních nádorů: zvl. prostaty, plic, prsu Př.: u cca 50% pacientů s karcinomerm prostaty: fuze genů TMPRSS2/ERG - del(21q22) TMPRSS2/ETV1 - t(7;21) ERG, ETV1 patří do rodiny ETS transkripčních faktorů Fuze genů: promotor androgen senzitivního genu TMPRSS2 (transmembránová serin-2 proteáza) stimuluje nadměrně ERG ev. ETV1

2. translokace protoonkogenů do pozice, ve které jsou abnormálně regulovány př. BL= Burkittův lymfom - t(8;14)(q24;q32) –i u jiných lymfomů a u B-ALL protoonkogen c myc z 8q přenesen na 14q do regulační oblasti (promotor) imunoglobulin.genů (geny pro těžké řetězce) - vysoká transkripční aktivita - nadprodukce normálního produktu (stálá exprese) podobné translokace: t(8;22), t(2;8) - translokace vedle promotorů genů pro lehké řetězce imunoglobulinů T-lymfo- malignity – zlomy v  blízkosti genů pro receptory T- buněk (chr.7) Týká se buněk, ve kterých dochází k somatické rekombinaci genomu (VDJ rekombinace Ig genů), jako součást procesu zrání efektorových buněk (B, T lymfocyty)

ncbi.nlm.nih.gov

Translokace produkuje pouze premaligní klon Zřejmě nutné další genetické změny jako mutace, epigenetické změny aj. pro plně maligní proces Translokace relativně častou příčinou malignit Nejvíce balancovaných translokací zjištěno u hematologických malignit, méně u solidních tumorů - u solidních tumorů průkaz chromozomální aberace a fuzních genů mnohem obtížnější

Geny účastnící se fuzí kodují: transkripční faktory důležité pro diferenciaci hematopoetických buněk – produkt fuzního genu pak zvýšeně aktivuje nadměrnou transkripci nebo naopak inhibuje transkripci př. represe transkripce genů pro myeloidní diferenciaci produktem fuzního genu PML/RARα = t 15/17 – receptor RARα se změněnou specificitou vůči ligandu – aktivuje histon deacetylázu *→ transkripční represe – u akutní promeylocytické leukemie –akumulace nezralých buněk tyrozinkinázy důležité pro regulaci proliferace fuzní gen brc/abl – chimerický protein se stálou tyrosin-kinázovou aktivitou – nekontrolovaná proliferace buněk * Acetylace histonů odstraní pozitivní náboj histonů – tím uvolní vazbu histonů s elektronegativní DNA = otevřený chromatin (aktivní) Deacetylace histonů obnoví pozitivní náboj histonů – to vede k vazbě mezi DNA a histony (a kondenzaci chromatinu– inaktivní chromatin - nepřístupný pro transkripční faktory)

Klinické využití v cílené terapii: např: imantinib (Gleevec)= inhibitor tyrozinkinázy u pacientů s fuzí bcr/abl (t 9/22) u chronické myeloidní leukemie (CML), akutní lymfoblastické leukemie (ALL), akutní myeloidní leukemie (AML) druhá generace bcr/abl inhibitorů = dasatinib, nilotinib (při reistenci na Imatinib) kyselina all-trans retinová (ATRA) účinná u pacientů s fuzí PML/RARα u pacientů s akutní promyelocytickou leukemií (APL) ATRA naruší interakci PML/RARa proteinu s jaderným korepresorem/histon deacetylázovým komplexem, který způsobuje potlačení transkripce

Jak a proč vznikají genové fuze aj. přestavby: Kritická léze = DSB (dvouvláknové zlomy DNA) – DSB - vznik působením zevních mutagenů (záření,chemické látky), z vnitřních příčin (reaktivní formy kyslíku..) i jako důsledek přirozených buněčných procesů jako V(D)J rekombinace Ig genů a receptorů T buněk, meiotická rekombinace apod. Chybná oprava dvouvláknových zlomů → aberantní rekombinace Specifické fuze – dány polohou chromozomů v interfázi a přítomností sekvenční homologie v místech zlomů – rekombinace mezi repetitivními Alu sekvencemi úloha tzv. „ fragile sites“ – fragilních míst (=místa genomové nestability)

Fragilní místa „fragile sites“ a nádory „Fragile sites“ (FS) místa genomové nestability pozdě se replikují nenáhodné lokusy - náchylné ke zlomům a rekombinaci manifestují se jako gap nebo zlom za podmínek replikačního stresu (tj. inhibice DNA syntézy – aphidicolin, 5.azacytidin, BUdR) FS – obecná – u všech lidí - vzácná u < 5% populace (expanze opakování tripletů, př.FRAXA) Dosud popsáno cca 121 různých FS V místech obec. FS leží tumor supresorové geny, protoonkogeny Obecná FS = cílové místo působení mutagenů/karcinogenů, integrace onkogenních virů 52% všech translokací u nádorů!! – zlomy v místech FS (Burrow et al. 2009)

Primární změny: Delece nádorových supresorových genů př. Retinoblastom dědičná forma - AD dědičnost (s neúplnou penetrancí) sporadická=nedědičná forma dědičný Rb: 1.stupeň: zárodečná mutace nebo delece - ve všech buňkách = heterozygot (konstituční abnormalita) 2.stupeň : mutace v 1 buňce retiny = ztráta heterozygozity (LOH) ztráta heterozygozity somatickou rekombinací del(13)(q141-142) sporadický Rb: mutace obou alel v 1 buňce retiny (pozdější nástup, obvykle postihuje pouze jedno oko)

Heterozygozita pro mutaci nebo deleci = predispozice k nádoru Imprinting tu su genu = pouze jedna funkční kopie !!

Retinoblastom mutace druhé alely v somatické buňce = ztráta heterozygozity heterozygot Ztráta heterozygozity: mutací, delecí, mitotickou rekombinací,ev.ztrátou chromozomu Dědičný RB/rb nebo RB/- Mutace nebo delece jedné alely → → → Sporadický Mutace obou alel postupně v 1 somatické buňce Knudsonova dvouzásahová teorie ztráty funkce tumor supresorového genu

Ztráta heterozygozity mitotickou rekombinací Heterozygotní stav v dceřinných buňkách segregace chromatid v mitóze Mitotická rekombinace replikace + heterozygozita Ztráta heterozygozity mitotickou rekombinací + Ztráta heterozygozity

př. Wilmsův tumor = nefroblastom Intersticiální delece 11p př. Wilmsův tumor = nefroblastom WT1 lokus na 11p13 – mutace nebo delece Výskyt: izolovaný nebo součást syndromu= WAGR (Wilms, aniridie, anomalie urogenitálu, mentální retardace) Další WT lokus (WT2) na 11p15 spojen s BWS Delece tu su genů důležité zvl. pro iniciaci epiteliálních tumorů

CHA se ziskem materiálu Amplifikace onkogenů: “double minutes” (DM) = amplifikované onkogeny-cirkulární - extrachromozomální (solidní tumory) HSR (homogenně se barvící oblasti) = amplifikace onkogenů a rekombinace do chromozomu (tandemně) nebo amplifikované sekvence vmezeřené do různých míst na chromozomech Amplifikované geny jsou normální – nemutované – efekt nadměrného množství produktu Amplifikace - výskyt u solidních nádorů : př. N-myc u neuroblastomu, cyklin D1 u mnoha nádorů (hl. jícnu) cyklin D2 u nádorů ovarií, varlat

Často amplifikováno více genů amplifikace (tj. nadměrná exprese) přispívá k nádorovému fenotypu Cílená léčba: Herceptin (trastuzumab)= monoklonální protilátka proti HER2/ERBB2 (=receptor tyrozin kinázy) u pacientek s nádorem prsu a amplifikací onkogenu ERBB2 Amplifikace některých nádorových genů je spojena s rezistencí na terapii (př. amplifikace DHFR spojena s rezistencí na léčbu methotrexatem, amplifikace bcr/abl genu u pacientů s CML resistentních na imantinib/Gleevec, amplifikace genu pro androgenní receptor u nádorů prostaty rezistentních na endokrinní léčbu)

Změny metylace u nádorů: Genom nádorových buněk hypometylován → aktivace onkogenů Některé geny hypermetylovány - hypermetylace promotoru → inaktivace tumor supresorových genů Metylace jako příčina mutací: deaminace 5-metyl-cytosinu , tj. C→ T Hypometylace vede k chromozomální nestabilitě (sekundární změny počtu nebo struktury chromozomů) Změny metylace – dysregulace imprintingu

Imprinting a nádory Nádor - důsledek epigenetických změn = změn v metylaci (imprintingu) protoonkogenů a tumor supresorových genů Imprintované protoonkogeny – porucha imprintingu → aktivace imprintované alely (biallelická exprese) = onkogeny Imprintované tumor supresorové geny – následná ztráta funkce jediné aktivní alely = ztráta funkce genu tj. pouze jeden stupeň je potřebný ke ztrátě funkce = zvýšená dispozice k nádorům

Polymorfismus imprintingu některých genů v populaci např. tumor supresorový gen WT1(11p13) IGF2R(6q26)=receptor růstového faktoru IGF2 (slouží k intracelulární degradaci IGF2) normálně bialelická exprese, ale u některých lidí exprese monoalelická (=imprinting) imprinting těchto genů = predispozice k nádorům Metylace = reverzibilní proces – možnosti terapie nádorů u kterých hraje roli aberantní metylace??

Chromozomální změny, které jsou důsledkem nádorového procesu, genomové nestability vznik deregulací genů zodpovědných za segregaci chromozomů nebo cytokinezi - Zisky materiálu: duplikace intragenové, jednotl. genů, skupin genů, chrom. částí, celých chromozomů Duplikace, trizomie : př.+8 při blastické krizi u CML, ANLL, MDS Hyperdiploidie, hypodiploidie – hyperdiploidie u ALL = dobrá prognóza ale hypodiploidie = špatná prognóza - Ztráty materiálu: delece intragenové, genů, skupin genů, chrom. částí, celých chromozomů

ztráty genetického materálu = ztráty nádorových supresorových genů ztráty genů kodujících mikro RNA (miRNA úloha v postranskripční regulaci genové exprese) zisky genetického materiálu = zisk (proto)onkogenů

Amplifikace onkogenu Her-2/neu(=ERBB2) v buňkách nádoru prsu – FISH

Trizomie and tetrazomie chromozomu 11 v buňkách nádoru prsu

Ztráta chromozomu 1 v buňkách nádoru prsu

Metody studia chrom.změn u nádorů: G- nebo R- pruhování fluorescenční in situ hybridizace (FISH) komparativní genomová hybridizace (CGH) a varianty těchto metod (mFISH, m-band, array CGH,..) Array CGH: porovnání testované a normální (referenční) DNA značené různými fluorochromy- testovaná DNA (1.barva) + kontrolní DNA (2. barva) - směs obou se nanese na sklo se ukotvenými DNA sekvencemi (hybridizace), - porovnání barevných bodů počítačem detekuje ztráty nebo zisky genetického materiálu.

Chromozomální aberace = markery prognózy a odpovědi na léčbu Umožnily identifikaci genů pro cílenou terapii Komplexní n. vícečetné změny = špatná prognóza, špatná odpověď na léčbu !!!

Karyotyp buňky nádoru prsu

Sy chromozomální nestability – sy se zvýšenou lomivostí chromozomů Společné rysy: AR dědičnost zvýšená senzitivita na UV ozáření změny pigmentace (hyper-, hypopigmentace) malý vzrůst defekty imunity zvýšená senzitivita na mutagenní poškození (zlomy, výměny, sesterské chromatidové výměny) vyšší spontánní hladina chrom.abnormalit, nebo zvýšená hladina po indukci mutagenem vysoké riziko malignit !! defekt replikace nebo reparace (geny odpovědi na DNA poškození)

Fanconiho anemie (FA) Bloomův sy (BS) panmyelopatie – pancytopenie abnormality skeletu, růstová retardace hyperpigmentace, snědá kůže event. mikrocefalie, defekt palce, radia není imunodefekt Aberace: zlomy a chromatidové výměny (i víceramenné, komplexní) Dg. Indukce aberací diepoxybutanem n. mitomycinem C více genů (heterogenní: 7genů FANC A-G) FA proteiny interakce s komplexem remodelujícím chromatin – porucha aktivace DNA reparace Bloomův sy (BS) opoždění růstu (trpaslictví) citlivost na oslunění imunodefekt (B-lymfo) motýlovitý exantém na obličeji vyšší výskyt: Aškenázští židé Aberace:zlomy, výměny mezi homologními chromozomy zvýšená hladina SCE (sesterské chromatidové výměny) defekt replikace, reparace dvouvláknových DNA zlomů (DSB) BLM gen - DNA helikáza

Ataxia teleangiectasia (AT –Louis-Bar sy) progresivní cerebelár.ataxie, růstová retardace sensitivita na ozáření okulokutánní teleangiektazie defekt imunity café au lait skvrny na kůži Aberace: přestavby zvláště chromozomů 7 a 14 ev. 2, 22 (místa genů pro receptory T lymfocytů a Ig genů) defekt rozpoznání signálu k reparaci, zvl. DSB – gen ATM (protein kináza reguluje TP53 gen) Xeroderma pigmentosum (XP) erytém po oslunění – atrofie, teleangiektazie – kožní nádory senzitivita zvl. na UV a ionizující záření Spontánní hladina aberací nezvýšena, zvýšení zlomů a SCE po indukci mutageny (zvl.UV záření) defekt reparace (zvl. excizní - NER, postreplikační repair, oprava zlomů DNA) -7typů : geny XPA-G + XPV – helikázy, nukleázy, DNA polymeráza (XPV-polEta)

Nijmegen breakage sy Růstová retardace, mentální retardace mikrocefalie, atypická facies defekt imunity porucha reparace dvouvláknových DNA zlomů Aberace: přestavby zvláště chromozomů 7 a 14 přestavby → neschopnost produkovat plně funkční Ig a receptory T lymfocytů → imunodefekt gen NBS1 (nibrin), oprava dvouvláknových zlomů DNA

Syndromy spojené s předčasným stárnutím : Wernerův sy Růstová retardace, katarkta, subkutánní kalcifikace, změny na kůži, předčasné šedivění, předčasná arterioskleróza defekt exonukleázové a helikázové aktivity, gen WRN = helikáza Cockaynův sy trpasličí vzrůst, mentální retardace , hluchota, předčasná senilita defekt excizní reparace, více genů (CSA, CSB)

Willman CH. L. and Hromas R. A Willman CH.L. and Hromas R.A.: Genomic alterations and chromosomal aberrations in Human Cancer – Google Fröling S.and Dohner H.: Chromosomal abnormalities in cancer, N Engl J Med 2008, 359, 722-34 Mitelman Database of Chromosome Aberrations and Gene Fusions in Cancer (2013). Mitelman F, Johansson B and Mertens F (Eds.), http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman ------ Thompson &Thompson: Klinická genetika, 6.vyd. Kap.16: Genetika a zhoubné bujení: Onkogeny, Tumor supresorové geny, Syndromy s choromozomovou nestabilitou, Cytogenetické změny ve zhoubných nádorech Kap.9: Mendelovsky dědičné choroby s cytogenetickými projevy, cytogenetické vyšetření u nádorových chorob + informace z prezentace