RNDr Z.Polívková Přednáška č. 523 –kurz: Vývoj buněk a tkání Chromozomy a nádory RNDr Z.Polívková Přednáška č. 523 –kurz: Vývoj buněk a tkání

Nádory jsou heterogenní skupinou chorob, jejichž iniciace a progrese je podorována změněnou funkcí genů, které regulují buněč.proliferaci, ovlivňují apoptózu, DNA reparaci, stabilitu genomu, angiogenezi, invazivitu a schopnost metastazovat tzv. „ nádorové geny“

Změny funkce genů ovlivněny: genovými polymorfismy změnami počtu kopií (amplifikace, delece, duplikace, změny počtu chromozomů) změnami struktury genů, chromozomů (translokace, inverze aj.) bodovými mutacemi (substituce, delece, inzerce v kodující sekvenci nebo na rozhraní exonů a intronů) epigenetickými modifikacemi (imprinting, metylace DNA a modifikace histonů-acetylace/deacetylace histonů, metylace n. fosforylace histonů)

Aktivace onkogenů (změna protoonkogenu na onkogen): mutace strukturní přestavba amplifikace epigenetické změny inzerce/transdukce viru Inaktivace tumor supresorových genů: delece epigenetické modifikace mitotická rekombinace

Chromozomální aberace (CHA) a nádory 1. Specifická CHA u nádorů - přestavby v blízkosti protoonkogenů - abnormální aktivita produktu - abnormální exprese genu přestavba pouze v nádorových buňkách (př. chronická myeloidní leukemie, Burkittův lymfom) - delece nádorových supresorových genů v nádorových buňkách nebo jako konstituční aberace (heterozygot) (př. retinoblastom) 2. Dědičné syndromy se zvýšenou lomivostí chromozomů defekt reparace nebo replikace  riziko malignit

Význam studia chromozomů u nádorových onemocnění: diagnóza a subklasifikace hematologických malignit racionální výběr terapie (cílená terapie) prognostické informace monitorování léčebného efektu, sledování reziduál.leukemie… studie mechanismu karcinogeneze CHA u nádorů: CHA beze ztráty materiálu: translokace, inverze CHA se ztrátou materiálu: delece, monozomie CHA se ziskem materiálu: duplikace, trizomie, polyploidie, amplifikace Primární změny souvisí s iniciací maligního procesu Sekundární změny – souvisí s progresí choroby

Primární změny : souvisí s iniciací choroby Translokace – 2 typy 1. Translokace při kterých vznikají fuzované geny (geny s funkcí v regulaci buněč.dělení a diferenciaci - protoonkogeny) př. CML = chronická myeloidní leukemie Ph1 chromozom = abnormální chr. 22 z t(9;22)(q34;q11) protoonkogen c-abl z 9q přenesen na 22q - chimerický gen (fuzovaný bcr/abl) → abnormální protein se stálou tyrozinkinázovou aktivitou → abnormální stimulace buněč.dělení Ph1 u CML znamená dobrou prognózu během blastické krize další změny (další Ph1, +8, i(17q), +19) U ALL (akutní lymfoblastická leukemie) jiná místa zlomu v oblasti bcr (zlomy v intronech genů) Ph1 u ALL = špatná prognóza

Cme.medscape.com

Fuzovaný gen brc/abl Wysis katalog 1996/97

Jiné příklady fuzovaných genů: ALL t(1;19) dobrá prognóza der(19)t(1;19) špatná prognóza t(12;21) dobrá prognóza akutní promyelocyt.leu (M3) t(15;17) dobrá prognóza akutní myelocytic leu (M2) t(8;21) dobrá prognóza ALL a AML t(4;11) špatná prognóza

T-lymfo- malignity – zlomy v blízkosti genů pro receptory T- buněk 2. translokace protoonkogenů do pozice, ve které jsou abnormálně regulovány př. BL= Burkittův lymfom - t(8;14)(q24;q32) – výskyt i u jiných lymfomů protoonkogen c myc z 8q přenesen na 14q do regulační oblasti imunoglobulin.genů (geny pro těžké řetězce) - vysoká transkripční aktivita - nadprodukce normálního produktu (stálá exprese) podobné translokace: t(8;22), t(2;8) - translokace do sousedství genů pro lehké řetězce imunoglobulinů T-lymfo- malignity – zlomy v  blízkosti genů pro receptory T- buněk Týká se buněk, ve kterých dochází k somatické rekombinaci genomu (VDJ rekombinace Ig genů), jako součást procesu zrání efektorových buněk (B, T lymfocyty)

ncbi.nlm.nih.gov

Geny účastnící se fuzí kodují: transkripční faktory důležité pro diferenciaci hematopoetických buněk – produkt fuzního genu pak zvýšeně aktivuje transkripci nebo naopak inhibuje transkripci (př. represe transkripce genů pro myeloidní diferenciaci produktem fuzního genu PML/RARα = t15/17 u akutní promeylocytické leukemie) tyrozinkinázy důležité pro regulaci proliferace Klinické využití v cílené terapii: např: imantinib = inhibitor tyrozinkinázy u pacientů s fuzí bcr/abl (t 9/22) kyselina all-trans retinová účinná u pacientů s fuzí PML/RARα (t15/17= fuzní gen PML/RARα vede ke změně specificity receptoru RARα vůči ligandu)

Jak a proč vznikají genové fuze aj. přestavby: Kritická léze = DSB (dvouvláknové zlomy DNA), vznik působením zevních mutagenů i z vnitřních příčin - vznik náhodný? Specifické fuze – dány polohou chrom. v interfázi a přítomností sekvenční homologie v místech zlomů úloha tzv. „ fragile sites“ – fragilních míst (=místa genomové nestability) Zřejmě nutné další genetické změny jako mutace, epigenetické změny aj. pro maligní proces- translokace produkuje pouze premaligní klon Nejvíce balancovaných translokací zjištěno u hematologických malignit, méně u solidních tumorů, zde změny komplexnější

V místech obec. FS leží tumor supresorové geny, protoonkogeny Fragilní místa „fragile sites“ a nádory „Fragile sites“ (FS) místa genomové nestability pozdě se replikují nenáhodné lokusy - náchylné ke zlomům a rekombinaci manifestují se jako gap nebo zlom za podmínek replikačního stresu (tj. inhibice DNA syntézy – aphidicolin, 5.azacytidin, BUdR) FS – obecná – u všech - vzácná u < 5% populace (expanze opakování tripletů, př.FRAXA) Dosud popsáno cca 121 různých FS V místech obec. FS leží tumor supresorové geny, protoonkogeny Obecná FS = cílové místo působení mutagenů/karcinogenů, integrace onkogenních virů 52% všech translokací u nádorů!! – zlomy v místech FS (Burrow et al. 2009)

Primární změny: Delece nádorových supresorových genů př. Retinoblastom dědičná forma - AD dědičnost (s neúplnou penetrancí) sporadická=nedědičná forma dědičný Rb: 1.stupeň: zárodečná mutace nebo delece - ve všech buňkách = heterozygot (konstituční abnormalita) 2.stupeň : mutace v 1 buňce retiny = ztráta heterozygozity (LOH) ztráta heterozygozity somatickou rekombinací del(13)(q141-142) sporadický Rb: postupné mutace obou alel v 1 buňce retiny (pozdější nástup, obvykle postihuje pouze jedno oko) Heterozygozita pro mutaci nebo deleci = predispozice k nádoru Imprinting tu su genu = pouze jedna funkční kopie !!

Retinoblastom mutace druhé alely v somatické buňce = ztráta heterozygozity heterozygot Ztráta heterozygozity: mutací, delecí, mitotickou rekombinací,ev.ztrátou chromozomu Dědičný RB/rb nebo RB/- Mutace nebo delece jedné alely → → → Sporadický Mutace obou alel postupně v 1 somatické buňce

Ztráta heterozygozity mitotickou rekombinací Heterozygotní stav v dceřinných buňkách segregace chromatid v mitóze Mitotická rekombinace replikace + heterozygozita Ztráta heterozygozity mitotickou rekombinací + Ztráta heterozygozity

Knudsonova dvouzásahová teorie ztráty funkce tumor supresorového genu Journal.cambridge.com

př. Wilmsův tumor = nefroblastom WT1 lokus na 11p13 – mutace nebo delece Výskyt: izolovaný nebo součást syndromu= WAGR (Wilms, aniridie, anomalie urogenitálu, mentální retardace) Delece tu su genů důležité zvl. pro iniciaci epiteliálních tumorů

Intersticiální delece 11p

CHA se ziskem materiálu Amplifikace onkogenů: “double minutes” (DM) = amplifikované onkogeny-cirkulární (solidní tumory) HSR (homogenně se barvící oblasti) = amplifikace onkogenů a rekombinace do chromozomu (tandemně) nebo amplifikované sekvence vmezeřené do různých míst na chromozomech Amplifikace - výskyt u solidních nádorů : př. N-myc u neuroblastomu, cyklin D1 u mnoha nádorů (hl. jícnu) cyklin D2 u nádorů ovarií, varlat Cílená léčba: Herceptin =monoklonál.protilátka proti ERBB2 (Her2/Neu=receptor tyrozin kinázy) u pacientek s nádorem prsu a amplifikací onkogenu

Chromozomální změny, které jsou důsledkem nádorového procesu vznik deregulací genů zodpovědných za segregaci chromozomů nebo cytokinezi – důsledek tzv. chromozomální nestability - Zisky materiálu: duplikace intragenové, jednotl. genů, skupin genů, chrom. částí, celých chromozomů Duplikace, trizomie : př.+8 při blastické krizi u CML, ANLL, MDS Hyperdiploidie, polyploidie – hyperdiploidie u ALL = dobrá prognóza ale hypodiploidie = špatná prognóza - Ztráty materiálu: delece intragenové, genů, skupin genů, chrom. částí, celých chromozomů - delece tu su genů, ztráty nekodujících genů (např.mikro RNA – role v posttransktripční regulaci genové exprese) ztráty chromozomů=ztráty tu su genů zisky chromozomů – zisk (proto)onkogenů

Amplifikace onkogenu Her-2/neu(=ERBB2) v buňkách nádoru prsu – FISH

Trizomie and tetrazomie chromozomu 11 v buňkách nádoru prsu

Ztráta chromozomu 1 v buňkách nádoru prsu

Metody studia chrom.změn u nádorů: G- nebo R- pruhování (banding) fluorescenční in situ hybridizace (FISH) komparativní genomová hybridizace (CGH) a varianty těchto metod (mFISH, m-band, array CGH,..) Array CGH: porovnání testované a normální (referenční) DNA značené různými fluorochromy- testovaná DNA (1.barva) + kontrolní DNA (2. barva) - směs obou se nanese na sklo se ukotvenými DNA sekvencemi (hybridizace), - porovnání barevných bodů počítačem detekuje ztráty nebo zisky genetického materiálu.

Komplexní n. vícečetné změny = špatná prognóza, špatná odpověď na léčbu !!!

Karyotyp buňky nádoru prsu

Sy chromozomální nestability – sy se zvýšenou lomivostí chromozomů Společné rysy: AR dědičnost zvýšená senzitivita na UV ozáření změny pigmentace (hyper-, hypopigmentace) malý vzrůst defekty imunity zvýšená senzitivita na mutagenní poškození vyšší spontánní hladina chrom.abnormalit, nebo zvýšená hladina po indukci mutagenem vysoké riziko malignit defekt replikace nebo reparace

Fanconiho anemie (FA) Bloomův sy (BS) panmyelopatie – pancytopenie abnormality skeletu, růstová retardace hyperpigmentace, snědá kůže event. mikrocefalie, defekt palce, radia není imunodefekt Aberace: zlomy a chromatidové výměny (i víceramenné, komplexní) více genů (heterogenní: 7genů FANC A-G) – porucha aktivace reparace Bloomův sy (BS) opoždění růstu (trpaslictví) citlivost na oslunění imunodefekt (B-lymfo) motýlovitý exantém na obličeji vyšší výskyt: Aškenázští židé Aberace:zlomy, výměny mezi homologními chromozomy zvýšená hladina SCE (sesterské chromatidové výměny) defekt replikace, reparace dvouvláknových DNA zlomů (DSB) BLM gen - DNA helikáza

Ataxia teleangiectasia (AT –Louis-Bar sy) progresivní cerebelár.ataxie, růstová retardace sensitivita na ozáření okulokutánní teleangiektazie defekt imunity café au lait skvrny na kůži Aberace: přestavby zvláště chromozomů 7 a 14 ev.2, 22 místa genů pro receptory T lymfocytů a Ig genů) defekt rozpoznání signálu k reparaci zvl. DSB – gen ATM (protein kináza reguluje TP53 gen) Xeroderma pigmentosum (XP) erytém po oslunění – atrofie, teleangiektazie – kožní nádory senzitivita zvl. na UV a ionizující záření Spontánní hladina aberací nezvýšena, zvýšení zlomů a SCE po indukci mutageny (zvl.UV záření) defekt reparace (zvl. excizní, postreplikační repair, oprava zlomů DNA) -7typů : geny XPA-G + XPV

Nijmegen breakage sy Růstová retardace, mentální retardace mikrocefalie, atypická facies defekt imunity porucha reparace dvouvláknových DNA zlomů Aberace: přestavby zvláště chromozomů 7 a 14 přestavby → neschopnost produkovat plně funkční Ig a receptory T lymfocytů → imunodefekt gen NBS1 (nibrin), oprava dvouvláknových zlomů DNA

Syndromy spojené s předčasným stárnutím : Wernerův sy katarkta, subkutánní kalcifikace, změny na kůži, předčasné šedivění, předčasná arterioskleróza defekt exonukleázové a helikázové aktivity, gen WRN Cockaynův sy trpasličí vzrůst, mentální retardace , hluchota, předčasná senilita defekt excizní reparace , více genů

http://dl1.cuni.cz/course/view.php?id=191 - prezentace http://dl1.cuni.cz/course/view.php?id=191 - doplňkový materiál k cytogenetice Event. Thompson &Thompson: Klinická genetika, 6.vyd. Kap.16: Genetika a zhoubné bujení: Onkogeny, Tumor supresorové geny, Syndromy s choromozomovou nestabilitou, Cytogenetické změny ve zhoubných nádorech Kap.9: Mendelovsky dědičné choroby s cytogenetickými projevy, cytogenetické vyšetření u nádorových chorob + doplnění informací z prezentace